Toxoplasma gondii Cysta Wall Bildning i aktiverade härledd från benmärg makrofager och Bradyzoite Villkor
Summary
Toxoplasma gondii omvandlas till en cysta formulär som svar på miljöpåfrestningar, som kan härmade i modellerna vävnadsodling. Denna video visar tekniker för att undersöka cysta väggen bildas genom att aktivera härledd från benmärg makrofager eller ändrar pH-tillväxt medium fibroblast celler.
Abstract
Toxoplasma gondii är en obligat intracellulär parasit som kan invadera alla kärnförsedda cell i varmblodiga djur. Under infektion, T. gondii sprider som en snabb replikering formulär som kallas tachyzoite. Tachyzoites konvertera till en långsamt växande encysted formen kallas bradyzoite genom ett signalsystem process som inte är väl karakteriserade. Inom djur, bradyzoite cystor finns i det centrala nervsystemet och muskelvävnad och representerar den kroniska skedet av infektionen. Konvertering till bradyzoites kan simuleras i vävnadskultur av CO 2 svält, med hjälp av medium med högt pH-värde, eller tillägg av interferon-gamma (IFNγ). Bradyzoites kännetecknas av närvaron av en cysta vägg, som lektin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binder. Fluorescerande DBA används för att visualisera cysta väggen i parasiter odlas i humana förhuden fibroblaster (HFFs) som har utsatts för låga CO 2 och högt pH medium. Likaså parasiter som bor i murina härledd från benmärg makrofager (BMMs) visa en cysta väggen upptäckas av DBA efter BMMs aktiveras med IFNγ och lipopolysackarid (LPS). Detta protokoll kommer att visa hur man kan få konvertering av T. gondii till bradyzoites med en hög medium pH tillväxt med låg CO 2 och aktivering av BMMs. Värdceller kommer att odlas på täckglas, infekterade med tachyzoites och antingen aktiveras med tillägg av IFNγ och LPS (BMMs) eller utsätts för högt pH tillväxt medium (HFFs) i tre dagar. Efter avslutad infektioner, kommer värdceller fastställas, permeabilized, och blockerade. Cysta väggar kommer att visualiseras med Rhodamine DBA med fluorescensmikroskopi.
Protocol
Discussion
Trots att mekanismen för bradyzoite utvecklingen inte är helt klarlagda, molekylärgenetiska analyser av T. gondii skede konvertering i vävnadskultur har lett till upptäckten av gener som är inblandade i bradyzoite cystbildning 2,3,4. Analyserna ledde också till observationen att vissa bradyzoite markörer uttrycks i andra långvarig stress villkor, inklusive tillväxt i aktiverade makrofager 5,6. Ovanstående metoder beskriver hur man odlar T. gondii och framkalla utvecklin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | heat inactivate | |
| Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin | Vector Laboratories | RL-1032 | ||
| Formaldehyde (16%) | Polysciences | 18814 | ||
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | ||
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | ||
| IFNγ | PeproTech | 315-05 | Store in single use aliquots | |
| L-glutamine (200mM) | Gibco | 25030 | ||
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391-1MG | Store in single use aliquots | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate) | Gibco | 31800-022 | ||
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200 | ||
| VectaShield mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).
- Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S. Identification and characterization of differentiation mutants in the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 44, 735-747 (2002).
- Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Mol Microbiol. 44, 721-733 (2002).
- J, P., Knoll, L. J. Isolation of Toxoplasma gondii development mutants identifies a potential proteophosphogylcan that enhances cyst wall formation. Molecular and Biochemical Parasitology. 169 (2), 120-123 (2010).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of Bradyzoite-Specific Toxoplasma gondii Antigens in Gamma Interferon-Treated Mouse Macrophages. Infection and Immunity. 61 (3), 1141-1145 (1993).
- Ibrahim, H. M., Bannai, H., Xuan, X., Nishikawa, Y. Toxoplasma gondii Cyclophilin 18-Mediated Production of Nitric Oxide Induces Bradyzoite Conversion in a CCR5-Dependent Manner. Infection and Immunity. 77 (9), 3686-3695 (2009).
- Lyons, R. E., McLeod, R., Roberts, C. W. Toxoplasma gondii tachyzoite-bradyzoite interconversion. Trends in Parasitology. 18 (5), 198-201 (2002).
- Berghaus, L. J., Moore, J. N., Hurley, D. J., Vandenplas, M. L., Fortes, B. P., Wolfert, M. A., Boons, G. J. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. , (2009).
- Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infection and Immunity. 62 (5), 1761-1777 (1994).
