Summary

더블 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션

Published: August 14, 2010
doi:

Summary

이 프로토콜은 아닌 방사성을 포함<em> 원위치</em척추 두뇌의 얇은 부분에서, 단일 셀 해상도로 두 사본 종의 동시 확인 가능> 하이브 리다이 제이션 절차.

Abstract

여기서 우리는 두 형광의 수정된 버전을 설명<em> 현장에서</em> 하이브 리다이 제이션 (dFISH) 메소드 신선한 냉동 뇌 부분에 대한 관심의 두 mRNAs 검출에 최적화된. 우리 그룹은 성공적으로 유전자 공동 규제를 공부하기 위해이 방법을 사용하고 있습니다. 더 구체적으로, 우리는 단세포 해상도의 해부 조직 neurochemical 특성, 및 중앙 감각 회로의 감각적 경험의 영향을 탐험이 dFISH 방법을 사용했습니다. 이 프로토콜은 쥐, 쥐 및 노래하는 새는에서 뇌 조직에서 검증된되었지만 쉽게 다른 척추 종 적용할뿐만 아니라 이외의 신경 조직의 배열로 될 예정입니다. 이 영화에서 우리는이 절차의 주요 단계에 대한 자세한 데모를 제공합니다.

Protocol

이 프로토콜은 이전에 뇌 조직 1-7에 하나 또는 두 개의 사본 수종을 감지하는 우리와 다른 사람에 의해 개발된 표준 방사선이 아닌 방사선 원위치 하이브리드화 방법에 따라 개발 및 정제되었다. 아래에서 설명하는 프로토콜은 최종 사용자가 선택한 절차 중단의 수에 따라 2 ~ 3 일 총 길이있다. 아래의 자세한 모든 단계가 riboprobe의 하이브리드화 단계 및 사후 하이브 리다이 제이션…

Discussion

우리는 척추 두뇌가 neurochemically 및 기능 구성 방법 연구, 어떻게 behaviorally – 관련 감각 자극에 미치는 영향 성인 뇌 8-10에서 뉴런의 게놈 기기 확인하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 우리는 성공적으로 마우스, 쥐 그리고 노래하는 새는에서 뇌 조직에서이 방법을 사용하지만,이 프로토콜은 척추 동물의 배열, 그리고 아마도이 아닌 신경 조직에서 얻은 뇌 부분에 쉽게 적용할 수?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NIH / NIDCD 및 RP에 슈미트 재단의 보조금에 의해 지원 작동합니다.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
DEPC   VWR IC15090225 toxic substance
PCR purification kit   QIAgen 28104  
Formaldehyde   VWR BDH0506-4LP toxic substance
T3 RNA polymerase   Roche 11031163001  
T7 RNA polymerase   Roche 10881767001  
Tris-HCl (1 M, pH 7.5)   VWR IC816124  
MgCl2 (1 M)   Sigma 449172  
Spermidine (1 M)   Sigma S0266  
DIG RNA labeling mix   Roche NC9380805  
Biotin RNA labeling mix   Roche NC9440104  
RNasin   Promega N2111  
BSA   Sigma 05491  
DTT   Sigma D5545  
Sephadex G50   VWR 95016-772  
EDTA   VWR 101384-758  
SDS   Sigma L4390  
Transfer (t)RNA   Invitrogen 15401011  
10X MOPS   VWR 14221-398 toxic substance
Paraformaldehyde   VWR AAAL04737-36 toxic substance
Sodium phosphate monobasic   Sigma S3139  
Sodium phosphate dibasic   Sigma S3264  
NaOH   VWR SX0600-1  
Triethanolamine   VWR IC15216391  
Acetic anhydride   VWR MK242002 toxic substance
SSPE   VWR 82021-488  
Formamide   VWR JT4028-1 toxic substance
Poly A   Invitrogen POLYA.GF  
Mineral oil   VWR IC15169491  
Chloroform   VWR BDH1109 organic solvent
Deionized formamide   Sigma F9037 toxic substance
Hydrogen peroxide   VWR VW36901 toxic substance
Tween 20   Sigma P1379  
Triton X-100   J. T. Baker X198-05  
Anti-DIG HRP   Roche 11093274910  
Anti-biotin peroxidase   Vector SP3010  
TSA Alexa Fluor 594   Invitrogen T20935  
TSA Alexa Fluor 488   Invitrogen T20932  
Hoechst   VWR 200025-538  
Vectashield   Vector H-1000  
embedding mold   VWR 15160-157  
cryostat   Leica CM 1850  
Superfrost plus slide   VWR 89033-052  

Solutions

  1. Column washing buffer: 10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0.1% SDS in 50 ml DEPC-treated water.
  2. Column blocking buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA in 50 ml DEPC-treated water.
  3. TNT buffer: 60 ml of 1 M Tris-HCl, 18 ml of 5 M NaCl and 1.8 ml of Triton X-100 in 600 ml of DEPC-treated water.
  4. TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 μg/μl BSA, 0.15 M NaCl and 3% Triton X-100 in DEPC-treated water.
  5. TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 plus 1 mM EDTA, pH 7.5.
  6. Acetylation solution: 2.7 ml of triethanolamine plus 0.5 ml of acetic anhydride in 200 ml of DEPC-treated water.
  7. Hybridization solution: 50% formamide, 2X SSPE, 2 μg/μl tRNA, 1 μg/μl BSA and 1 μg/μl poly A in DEPC-treated water. It needs 16 l per section.

References

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Cite This Article
Jeong, J. K., Chen, Z., Tremere, L. A., Pinaud, R. Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections. J. Vis. Exp. (42), e2102, doi:10.3791/2102 (2010).

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