ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג'ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים
Summary
ב electroporation ברחם היא שיטה ערך עבור transfecting ובתאים עצביים in vivo. בהתאם למיקום של אלקטרודות ואת timepoint ההתפתחותי של electroporation, תת מסוימים של תאים בקליפת המוח יכול להיות ממוקד. התאים הממוקדים אז יכול להיות מנותח in vivo או במבחנה על ההשפעות של שינוי גנטי.
Abstract
במחקר במבחנה של תרבויות העצבית העיקרי מאפשר ניתוחים כמותיים של תולדה neurite. על מנת ללמוד כיצד משפיעים שינויים גנטיים תולדה תהליך עצבי, או בונה shRNA cDNA יכול להיות מוחדר דרך נוירונים העיקרי transfection כימיים או התמרה ויראלית. עם זאת, עם תאים בקליפת המוח העיקרי, בריכת הטרוגנית של סוגי תאים (נוירונים glutamatergic משכבות שונות, נוירונים מעכבים, ותאי גלייה) הם transfected שימוש בשיטות אלה. השימוש ב electroporation ברחם להציג בונה DNA בקליפת מכרסם עובריים מאפשרת תת מסוימים של תאים להיות ממוקד: בעוד electroporation של עוברי מטרות שכבות מוקדם קליפת עמוק של קליפת המוח, electroporation ב timepoints עובריים מאוחר מטרות שכבות שטחית יותר. יתר על כן, מיקום ההפרש של אלקטרודות על פני ראשיהם של עוברי תוצאות בודדים המיקוד של אזורים הגבי-המדיאלי לעומת הגחון-רוחבי של קליפת המוח. בעקבות electroporation, תאים transfected יכול להיות גזור החוצה, ניתק, והוא מצופה במבחנה על ניתוח כמותי של תולדה neurite. כאן, אנו מספקים שיטה צעד אחר צעד כדי למדוד כמותית תולדה תהליך תת העצבית של תאים בקליפת המוח.
הפרוטוקול הבסיסי של electroporation ברחם תוארה בפירוט בשני מאמרים יופיטר אחרים מן המעבדה Kriegstein 1, 2. אנו נספק סקירה כללית של פרוטוקול שלנו ב electroporation ברחם, תוך התמקדות בפרטים החשובים ביותר, ואחריה תיאור של פרוטוקול שלנו, כי חל electroporation ברחם כדי לחקור את תפקוד הגן תולדה תהליך עצבי.
Protocol
Discussion
במחקר במבחנה של תרבויות העצבית העיקרית לאפשר ניתוחים כמותיים של תולדה neurite. על מנת ללמוד כיצד משפיעים שינויים גנטיים תולדה תהליך עצבי, או בונה shRNA misexpression יכול להיות מוחדר דרך נוירונים העיקרי transfection כימיים או התמרה ויראלית. עם זאת, עם תאים בקליפת המוח העיקרי, בריכ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות יוסף LoTurco ודניס Selkoe לדיונים מועיל על הטכניקה הזו. המחברים מודים לתורמים של קרן הבריאות האמריקאית לסיוע, לתמיכה של מחקר זה.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cortical Neuron Preparation | ||||
| Dissection Media: | ||||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free) | Gibco | 14185-052 | ||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 ) | Gibco | 14065-056 | ||
| 1M HEPES pH 7.4 | Gibco | 15630-080 | ||
| Dishes and Vials: | ||||
| 100 x 15 mm Petri Dishes | Fisherbrand | 08-757-12 | ||
| 60 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351007 | ||
| 15 mL conical vial | Sarstedt | 62-547-205 | ||
| 50 mL conical vial | Sarstedt | 62-554-205 | ||
| Dissection Tools: | ||||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | ||
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | ||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | ||
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | ||
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Miscellaneous: | ||||
| .25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | ||
| Hand-Held Tally Counter | Sigma | Z169021 | ||
| Plating Medium: | ||||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | ||
| Growth Medium: | ||||
| NEUROBASAL Medium | Gibco | 21103-049 | ||
| B-27 Serum-Free Supplement | Gibco | 17504-044 | ||
| GlutaMAX -I Supplement | Gibco | 35050-061 | ||
| Gentamicin Reagent Solution | Gibco | 15750-060 | ||
| Immunostaining: | ||||
| Fixative, Washes, and Blocking Buffer: | ||||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | ||
| Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | ||
| Antibodies: | ||||
| beta-III tubulin antibody | Chemicon | MAB1637 | ||
| MAP2 antibody | Chemicon | AB15452 | ||
| Donkey Cy3 anti-mouse | Jackson Immuno | 715-166-151 | ||
| Donkey Cy2 anti-chicken | Jackson Immuno | 703-226-155 | ||
| DAPI | Gibco | D3571 | ||
| Slide Preparation: | ||||
| CC2 Coated Two-Chamber Slides | Lab-Tek | 154852 | ||
| Fluorescent Mounting Media | KPL | 71-00-16 | ||
| 24 x 60 mm Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | ||
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | ||
| Electroporation: | ||||
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | ||
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | ||
| buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | ||
| Picospritzer III | Parker | |||
| BTX square wave electroporator | Fisher | BTXECM830 | ||
| Tweezertrodes, 7 mm, platinum | Harvard Apparatus | 450488 |
References
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).
- Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).
- Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain. Dev Neurosci. , 144-156 (2008).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).
