Electroeluting קטעי DNA

Summary

הליך זה מאפשר טיהור של קטעי DNA עם תשואה גבוהה.

Abstract

שברי DNA מטוהרים המשמשים למטרות שונות בביולוגיה מולקולרית והם יכולים להיות מוכן על ידי נהלים שונים. רובם דורשים אלקטרופורזה קודמות של שברי DNA על מנת להפריד את הלהקה של עניין. לאחר מכן, הלהקה הזו הוא נכרת מתוך ג'ל agarose או acrylamide וטיהר באמצעות אחת: מחייב elution מן החלקיקים זכוכית או סיליקה, DEAE-תאית ממברנות, "למחוץ ולספוג שיטה", electroelution או לעתים קרובות מאוד יקר ערכות טיהור מסחרי. לכן, בחירת השיטה יהיה תלוי בעיקר מה זמין במעבדה. ההליך electroelution מאפשרת לטהר DNA נקי מאוד לשמש במספר רב של יישומים (רצף, radiolabeling, הגבלה האנזימטית, שינוי אנזימטי, וכו 'שיבוט). הליך זה מורכב הצבת להקת DNA המכיל פרוסות agarose או acrylamide לתוך בארות מדגם של electroeluter, ולאחר מכן להחיל הנוכחי יהפוך את קטע הדנ"א לעזוב את agarose ובכך להיות לכודים מלח כרית להיות התאושש מאוחר יותר על ידי משקעים אתנול.

Protocol

על מנת לבחור שברי DNA של עניין להיטהר, אלה צריכים להיפתר agarose או ג'לים acrylamide ג'ל מוכתם ברומיד ethidium ידי אלקטרופורזה באמצעות חיץ TBE 0.5X (טריס borate, EDTA) ב 120 וולט במשך שעה 1. לשם כך, ~ 700 ננוגרם של פלסמיד pProEx-GdMre11S (6000-bp) מתעכל בעבר עם NdeI ו HindIII שימש לשחרר קטע 900-bp (560 ננוגרם של ng פלסמיד ו 84 של שבר). הטנק electroeluter (איור 1) צריך להיות מלא עם TBE 0.5X מופץ באופן שווה בכל צד של הרמה באמצע מטפלת לא לשפוך אותו על הרמה באמצע. הלהקה שנבחרה (או רצועות) הוא לגזור של הג'ל, והניח בתא מדגם קרוב ככל האפשר אל הערוץ V (פרוסה אחת לכל היטב). חיץ ריצה יש להוסיף חדר אחד; מספיק כדי לכסות את הפרוסה ג'ל. כל ערוץ V בשימוש חייב להיות סמוקות עם פיפטה פסטר לחסל כל בועת אוויר לכוד. אז 100 ul של 10 אצטט M 4 NH (כדי להקל על ויזואליזציה כמות קטנה של כחול bromophenol הוא הוסיף, מספיק כדי צבע זה) מוסיפים בעדינות בתוך ערוץ ה-V. המכסה יש לסגור בעדינות כדי למנוע כל resuspension של כרית מלח גבוהה. Electroelution הוא החל ב -100 וולט במשך 25 דקות. כאשר electrolution הושלמה, 400 ul יוסרו V-channel, והניח בתוך שפופרת microfuge להיות זירז עם 2 כרכים של אתנול הגליקוגן קר (מומלץ לשפר את ההתאוששות DNA) בשעה 4 ° C למשך שעה 1 או לילה. צנטריפוגה במשך 20 דקות, להסיר ולשטוף supernatant עם אתנול 70%. צינור יבש ולכמת את ה-DNA OD 260 ננומטר. ההתאוששות שהושג היה 75% (63 ng התאושש כאשר 84 ng הונחו על ה-V-channel). איור 1. דיאגרמה Electroeluter. Anod קטודה מצוינים בכל צד של ה-DNA טנק, הכלול ג'ל פרוס (מאויר כמו ריבוע שחור) יהגרו לכיוון הקתודה בשל מטען שלילי שלה. ואז זה יהיה לכוד בתוך כרית מלח (כפי שהוא מיוצג משולש שחור הפוך) ממוקם ה-V-הערוץ.

Discussion

משך הריצה יהיה תלוי מאוד על גודל של שברים, בדרך כלל שברי עד 20 kb 50 דקות עד שעה 1 מספיק, בעוד שברי קטן אור UV ניטור כל 10 דקות נדרש כדי למנוע שבר לעבור את מלח כרית ועקב לחדר חיץ anodal ירידה התאוששות. חשוב לוודא כי כאשר אתה מגדיר אספקת החשמל שלכם ב 100 וולט, יש mAmp הנוכחי של לפחות 10. להקת ה-DNA ניתן לנטר באמצעות מנורת UV-יד לזהות מתי זה נוטש את הפרוסה ג'ל. מלח כרית אפשר גם עם אצטט 3 Na M.

הליך זה מאפשר טיהור של שברי דנ"א או רנ"א בגדלים שונים עם התאוששות טובה (~ 80%) להיות radiolabeled, מתעכל על ידי אנזימי הגבלה, מעובד על ידי האנזימים שינוי, וכו '

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
NdeI		New England Biolabs	R0111L
HindIII		New England Biolabs	R0104L
NH4 acetate		JTBaker	0596
agarose		Invitrogen	15510-027
Biophotometer		Eppendorf	6131 000 020
Electroeluter		IBI	UEA CAT 46000