Intrakranielle Injektion von Adeno-assoziierte virale Vektoren
Summary
Hier präsentieren wir die intrakranielle Injektion von AAV-Vektoren für die Fluoreszenzmarkierung von Neuronen und Gliazellen in der Sehrinde.
Abstract
Intrakranielle Injektion von viralen Vektoren entwickelt, um ein fluoreszierendes Protein exprimieren ist eine vielseitige Kennzeichnung Technik zur Visualisierung von bestimmten Untergruppen von Zellen in verschiedenen Hirnregionen in vivo und in Hirnschnitten. Anders als die Injektion von Fluoreszenzfarbstoffen, bietet virale Kennzeichnung der gezielten Förderung einzelner Zelltypen und ist weniger teuer und zeitaufwendig ist als Einführung transgener Mauslinien. Bei dieser Technik wird ein Adeno-assoziierte Viren (AAV) Vektor injiziert intrakraniell mit stereotaktischen Koordinaten einer Mikropipette und eine automatische Pumpe für präzise Lieferung von AAV auf den gewünschten Bereich mit minimaler Schädigung des umliegenden Gewebes. Injection-Parameter können auf einzelne Experimente durch Anpassung der Tier-Alter an der Injektionsstelle, Injektion Lage, Injektionsvolumen, die Rate der Injektion, AAV-Serotyp und der Promotor, der die Genexpression zugeschnitten werden. Je nach den gewählten Bedingungen kann viral-induzierter Transgenexpression erlauben die Visualisierung von Gruppen von Zellen, einzelne Zellen oder feinen zelluläre Prozesse, bis auf die Ebene von dendritischen Dornen. Die hier gezeigten Experiment zeigt eine Injektion von doppelsträngiger AAV, die grün fluoreszierendes Protein für die Kennzeichnung von Neuronen und Gliazellen in der Maus primären visuellen Kortex.
Protocol
Discussion
Viral-vermittelte Gentransfer birgt ein großes Potenzial für die Untersuchung der neurologischen Prozesse und Behandlung von Störungen des Gehirns 1,2,3. Die große Vielseitigkeit dieser Technik kann auch genutzt werden, um Fluoreszenz-Label-Zellen für die Bildgebung sowohl in vitro und in vivo 4 sein. Hier zeigen wir ein detailliertes Verfahren für die Transduktion von Neuronen und Gliazellen in Maus visuellen Kortex mit einer doppelsträngigen Adeno-Verein Virus, das Enhanc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde ermöglicht durch Zuschüsse aus dem NIH (EY012977), ein Career Award in der Biomedizin von der Burroughs Wellcome Fund, der Whitehall-Stiftung, und die Sloan Foundation (AKM).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Stoelting Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51625 | Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted | |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Fine Science Tools | 14084-08 | ||
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Fine Science Tools | 11152-10 | ||
| Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled | Fine Science Tools | 11251-35 | Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy | |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Fine Science Tools | 11000-12 | ||
| Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Dental drill | |
| Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-14 | ||
| Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul | VWR International/ Drummond | 5-000-1001 or 53480-287 | ||
| Mineral oil | VWR International | 29447-338 | ||
| Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed) | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3-R | Used for determining stereotaxic co-ordinates | |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | ||
| Sutures | VWR International | 95056-952 | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
| Tobradex | Available from your institution’s veterinary services |
References
- Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O’Malley, K. L., During, M. J. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet. 8, 148-154 (1994).
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