我们制定了一个敏感的技术标签在单个细胞中新合成的线粒体DNA(mtDNA),为了研究线粒体DNA的生物合成。该技术结合了一个酪胺信号放大(TSA)协议EDU纳入可视化的神经元亚细胞车厢内线粒体DNA的复制。
线粒体是细胞能量的线粒体生物合成的关键调节是调节在 1-3健康细胞的线粒体数目的重要组成部分。监测线粒体生物合成的方法之一是利率来衡量的线粒体DNA(mtDNA) 复制 4 。我们制定了一个敏感的技术来标记新合成的单个细胞中的线粒体DNA,为了研究线粒体DNA的生物合成。该技术结合了5 -乙炔- 2' -脱氧尿苷(EDU)一个酪胺信号放大(TSA)协议,以可视化神经元亚细胞内的线粒体DNA 复制 5-7纳入。 EDU是优于其他胸苷类似物,如5 -溴-2 -脱氧尿苷(BrdU),因为最初的点击反应标签EDU 5-7不需要苛刻的酸处理或酶消化,揭露BrdU抗原表位。 EDU温和的标签,允许其注册成立的直接比较,与其他细胞标记9-10。线粒体DNA的生物合成的能力,可视化和量化调查,用来调节线粒体的生物合成和与药物毒性反应,延缓衰老,癌症和神经退行性疾病相关的发病机制提供了洞察机制提供了一个必不可少的工具。我们的技术是适用于感觉神经元以及其他类型的细胞。使用这项技术来衡量线粒体DNA的生物合成有重大影响,在促进双方正常的细胞生理学以及受损的疾病状态的理解。
我们开发了一种新合成的标签使用EDU酪胺信号放大的单个细胞中的线粒体DNA的敏感检测。在这个协议的优化最大的问题之一是盖玻片之间的不一致的结果。更改了Invitrogen公司试剂盒协议,以避免小卷和个人盖玻片混合,使主的解决方案,使用的所有盖玻片。 75-80μL,每12毫米的圆形玻璃盖玻片使用,是一种理想的体积完全覆盖的表面积,同时提供足够的解决方案给的样本之间的一致的结果。孵育时间和试剂浓度进行了优化,但可能与他们的调整改进。
该协议被设计为运行的每个进程一次。然而,一些步骤已经多次与新的解决方案,恢复后的第一次尝试失败的样本。特别是,EDU点击反应步骤(3.4-3.6)曾多次没有显着增加的背景荧光。俄勒冈州的反绿HRP抗体孵育(4.1-4.3)和酪胺扩增(4.4-4.5)的步骤也被反复,但更多的时候在一个贫穷的信号,因为增加的背景荧光信噪比的结果。
最敏感的试剂点击EDU缓冲添加剂(分量G)和点击EDU微孔板检测试剂盒的兔抗俄勒冈州绿色辣根过氧化物酶抗体(组件)。点击EDU缓冲添加剂逐渐变成黄色随着时间的推移时,保存在4 ° C和6-12个月之间大大变暗。点击埃杜在-20℃的缓冲添加剂的存储C将缓解这个问题。标签和酪胺扩增步骤的工作最好是在4-6个月重组MilliQ DH 2 O内使用兔抗俄勒冈州绿色辣根过氧化物酶抗体
EDU线粒体轻度标签允许额外的9-11细胞标记进行直接的比较和增强这种技术,如5 -溴-2 -脱氧尿苷(BrdU),这就要求苛刻的治疗恢复超过其他胸苷类似物的效用,其抗原表位内的DNA。我们的实验室11-12和13-15已经成功地使用BrdU标签线粒体。 BrdU标记技术EDU使用一个类似的,但有一些重要的差异(图5)。上面列出的通透性步骤(3.1-3.2)后,BrdU抗原表位的是恢复一个变性步骤(2 N的盐酸为30分钟,在37 ° C的三个在1X PBS洗涤)。 BrdU,然后与标记抗体对BrdU(矢量实验室在1%封闭液稀释1:50从TSA试剂盒孵育4℃过夜)。二抗步骤是必需的放大BrdU的信号(标记的羊抗鼠IgG HRP该协议套件#2和#5在1%封闭液稀释1:100,并在室温下45分钟孵育)之前的该协议的步骤(4.3-4.5上面)。有两个胸腺嘧啶核苷类似物,埃杜和BrdU,标签的mtDNA是执行双重标签线粒体可以按顺序在脉冲标签范例11标记实验有利。
我们的实验室是使用EDU和BrdU mtDNA的标签,以检查在糖尿病神经病变,糖尿病常见的并发症中的线粒体生物合成的调控。我们已经成功地用于信号放大来衡量线粒体生物合成的单个神经元的变化11-12。在其他实验旨在探讨线粒体DNA的复制和营业额或确定线粒体DNA合成的药物,抑制的机制中,这种技术将是有益的的。此外,放大埃杜和BrdU信号的基本原则可以应用到其他的研究,措施DNA复制或修复。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了国家卫生赠款研究院NS – 38849和DK – 076160,青少年糖尿病研究基金会糖尿病并发症的研究中心,神经病学研究和发现的A.阿尔弗雷德陶布曼医学研究所在方案美国密歇根大学。这项工作所使用的形态和密歇根州的糖尿病研究和培训中心由国家卫生部批准5P60 DK – 20572研究院从美国国立糖尿病,消化道和肾脏疾病研究所资助,图像分析的核心。作者要感谢他的宝贵意见,从分子探针/ Invitrogen公司的斯科特T.克拉克各种点击EDU标记试剂盒和试剂的慷慨捐赠,以支持EDU扩增技术的初步发展。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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12 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-82 | ||
245 mm x 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | ||
Parafilm M | Fisher Scientific | PM-996 | ||
paraformaldehye | Sigma-Aldrich | P6148 | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8532 | ||
Phosphate buffered saline 10X solution | Fisher Scientific | BP399 | ||
Transfer Pipet | Fisher Scientific | 13-711-7M | ||
Hydrogen peroxide, 30% in water | Fisher Scientific | BP2633 | ||
Click-iT EdU Microplate Assay Kit | Invitrogen | C10214 | ||
TSA Kit #12, with HRP—goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyramide | Invitrogen | T20922 | ||
TSA Kit #15, with HRP–goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 594 tyramide | Invitrogen | T20925 | ||
ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | ||
Polyclonal rabbit Neurofilament antibody | Chemicon | AB1981 | ||
Mouse monoclonal anti-BrdU antibody | Vector Laboratories | VP-B209 | ||
TSA Kit #2, with HRP—goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide | Invitrogen | T20912 | ||
TSA Kit #5, with HRP—goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 594 tyramide | Invitrogen | T20915 |