直立成像果蝇胚胎

Summary

在这里，我们提出了一个彩绘的安装协议<em>果蝇</em>在直立位置，允许使用共聚焦显微镜的横截面成像的胚胎。

Abstract

几家知名形成梯度和细胞运动发生沿背/腹轴<em>果蝇</em>胚胎。然而，使用目前的技术，以查看这些进程的比较有限。以下协议描述了一种用于安装固定和标记的新技术<em>果蝇</em>冠状观看共焦成像的胚胎。这种方法包括嵌入两层甘油果冻安装媒体之间的胚胎，直立定位和成像果冻条。夹在胚胎的第一步是使甘油果冻的幻灯片上的薄被褥。下一步，胚胎仔细对齐这种表面上覆盖着第二层的果冻。第二层是凝固后，果冻条被切断，翻转直立成像。介绍了替代品，用于可视化取决于要使用显微镜支架类型的胚胎。由于沿背腹轴的所有细胞都在一个单一的共焦Z平面成像的，我们的方法允许未经漂白或光散射共同纵向安装的胚胎的三维重建的荧光信号的精确测量和比较。

Protocol

1。成像方法在55 ° C度为20-30分钟水浴融化甘油，果冻，直到它变成一个同质的液体。漩涡，但不摇瓶，以避免形成泡沫。 虽然果冻的融化，适用于使用一个干净的玻片上（可选）一个Kimwipe一层薄薄的甘油。 移液器1至1.5毫升溶化甘油果冻上使用的幻灯片的表面削减P1000的枪头，创建一个薄的第一层。小心吸取试剂，以避免气泡。 让果冻固化5分钟一个水平的表面上，然后放置在-20 ° C 5分钟的幻灯片，并进行胚胎对齐。另外，用保鲜膜覆盖的幻灯片，并在4 ° C至5天。 移液器染色胚胎小降了70％的甘油/ PBS或其他抗淬灭甘油为基础的安装媒体（例如Slowfade或Vectashield）果冻床上用品一侧。 开始预调胚胎单独转让果冻表面下降。他们转移使用一个倾斜的注射针，用勺子倾斜侧壁。 大致的地方沿2〜3列的胚胎。如果一个胚胎获取滞留针，搅拌它包含其他的胚胎来释放它的下降。仔细对准他们在这一点上，不要浪费时间。列之间留一些空间。 将胚胎滑的果冻中等水平皮下注射针头的援助。虽然滑动，东方的头和尾巴在同一方向。使他们彼此平行沿柱。删除与一块扭曲Kimiwipe的足迹留下的PBS甘油的过剩。 注意：过量的甘油会导致胚胎内凝胶松散的包裹，导致两个果冻层的分离，使其难以切割和装入。相反，清除过多的甘油就会枯竭和扁平化的胚胎。 使用切割黄尖遍布一层薄薄的胚胎（50-150μL，对齐多少而定）的果冻。 将幻灯片，在-20 ° C冰箱10-20分钟，或保存在4 ° C过夜。确保果冻是完全刚性的，切割前。否则，胚胎块将很难消费。切割的最好成绩是获得翌日。 根据解剖范围，使用刀片完全对齐的胚胎两侧穿过果冻。保持在90度角直线切割刀片。这次裁员应该是非常接近的胚胎的前部和后部的两极，以避免过量的果冻，可能会阻碍成像。 加入100-200μL冷PBT（4 ° C，PBS +0.1％吐温20）未来的削减，小心地刮去使用抹刀的胚胎之间的果冻。 注：在PBT的洗涤剂帮助果冻取消不损害胚胎的情况下的幻灯片。 用针，转让与嵌入式胚胎进一步削减到一个干净的幻灯片的果冻块。 5-7胚胎切割更小的块。使用PBT轻松地左右移动的果冻块。另外，放置在干燥的玻璃表面块让它附着于玻璃，创造更多的精确修剪果冻，如果有必要的稳定。 翻转直立在果冻的嵌入式刀片和针援助的胚胎。在显微镜下可视化，进行下面的两个步骤中的任一个，视显微镜上的立场正在使用。 倒置显微镜：地方完成到盖玻片的胚胎与胚胎在直立位置，块。确保果冻量最少的胚胎方将加强与客观联系。 立式显微镜：四个＃1盖玻片被用来作为“支持”和地方之间的“支持”，在甘油中的胚胎块用强力胶胶合两个栈。大桥的堆栈使用长盖玻片。 共聚焦分析，检查工作要使用的目标的距离，找出是否可以形象通过胚胎或仅部分。例如，D.果蝇胚胎〜0.55毫米，长度和使用计划一个蔡司20X – APO或40X LD新福陆公司的目标可以完全成像。下面的网站有可用蔡司目标的信息，让您选择搜索目标，根据工作距离：https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php 2。代表性的成果因为胚胎将保持不变，这种方法可用于精确的测量胚胎的大小和基因表达模式之间的距离。在图1中，我们显示一个核染色的DAPI（蓝色），反背蛋白（红色），SOG的mRNA（黄色）和SNA的mRNA（绿色）染色的胚盘阶段的胚胎。形态议事录SES，如内陷（图2A，B）的中胚层和中胚层细胞（图3和4）迁移也可以可视化使用此方法。不同沿DV轴Z轴位置可通过改变焦平面，如在图2-4所示。 图1。直立式光学切片一个完整的胚胎中胚阶段。mRNA和蛋白的双重染色。图中的靶mRNA 原位探测（SOG和SNA）和抗体染色的蛋白（反手背）表示。 DAPI是用来标记细胞核。注意位于顶部SOG和SNA的表达在细胞质中，而背的表达是核。 SOG新生的成绩单，位于细胞核的强有力的信号，也可以看到在这个放大倍数。 图2。一个完整的胚胎gastrulating直立成像。基因探针和各自的颜色如图所示。一）请注意，在这个阶段，三个基因相同的福陆公司（SNA，SOG和民进党，绿色），染色，表示在空间上分离的的域中。内陷中胚层表示SNA，成神经细胞层表示IND和外胚层表示， 民进党SOG的表达，而在腹侧神经系统的地区仍然存在。 B）在一个更深的共聚焦平面相同的胚胎，我们注意到强烈表示 SNA内陷中胚层的基础，但它的顶端区域表达水平较低。 图3。一个完整的胚胎与生殖带直立成像扩展 SOG RNA（黄色）; 蜗牛，IND和民进党的mRNA（绿色），背蛋白（红色）。细胞核用DAPI染色（蓝色）。一）焦平面胚胎头部附近。 B）另一个在同一胚胎的躯干地区的焦平面。注意群众中胚层细胞的横向迁移前，躺在生殖波段扩展胚胎两侧靠近腹侧中线（比较图4）。分层神经母细胞被标记为绿色（IND和SNA）。 图4。一个完整的胚胎生殖波段扩展期间 SOG RNA（黄色）; 直立成像。 蜗牛，IND和民进党的mRNA（绿色），背蛋白（红色）。 A）注分层神经母细胞从上皮细胞（箭头），染色IND和SNA都在这个阶段（绿色）。还要注意的SOG限制表达的腹侧中线（黄色）。胚胎（星号）的侧面可以看出，民进党在这个阶段中的表达。二）在同一胚胎的光学部分显示在一个胚胎的长度，对应于中后区附近。腹侧中线细胞染色SOG。

Discussion

以果蝇胚胎的横截面图像可以是具有挑战性，因为它需要^一个 2片或切片处理，这通常是有害的荧光染色法的嵌入式媒体使用小心手清扫。另外，在共聚焦显微镜的Z -堆栈可用于截面图像三维重建。然而，这是费时，成为问题的一个精确的三维重建和漂白几个薄的共焦片。另一个值得关注的时候，成像纵向安装的胚胎是达到更深的胚胎，这也复杂荧光信号的精确测量，量化蛋白^或 mRNA表达水平1的目的时，会发生光散射。即使与双光子共聚焦显微镜，光的散射仍然是一个关注，由于卵黄物质的胚胎，这使得选择最佳样品的透明度是有限的安装媒体中的不透明度。

为了规避这些问题，新技术，所谓的“最终”成像定位胚胎的垂直是最近开发的图像直播和^固定样本4。在本文中，我们开发了一个垂直安装的胚胎的新协议，允许一个简单的编制和固定的胚胎^组织 或染色3原位探测与多个任意大小和形状的可视化。我们的方法包括使用凝胶状的一致性用来包住对齐胚胎内安装媒体。本安装媒体包含嵌入式胚胎切割块可以放置在任何类型的共聚焦显微镜成像前直立。

嵌入到果冻的胚胎和它们垂直定位，我们可以采取横向的横截面，使用共聚焦显微镜，在沿背腹轴的胚胎细胞同时呈现。这是一个量化的目的，因为光散射和漂白的荧光染料，在传统的Z – Stack纵向安装的胚胎重建发生，现在淘汰的问题显着改善。因此，沿背腹轴的基因表达或蛋白质水平的定量准确，因为在同一时间和相同的共焦的Z -位置位于对面的背腹位置的细胞成像。此外，所描述的方法可以让我们获得一个完整的2 – D图像，而无需使用复杂的计算展开方法，可视化细胞在不同的岗位沿^DV轴6的跨越，从一个3 – D胚胎背腹轴。

一些关键步骤包括调整胚胎后，删除多余的甘油，以避免分裂的果冻两层之间。然而，如果样品是太脱水，生成的图像将被畸形，并有不正确的的形态。此外，如果胚胎周围的胶状介质是减少而不是直接的角度，产生的图像可能会出现更全面，更ovular的形状，由于胚胎在90度以外的角度的位置不正确。最后，如​​果果冻是不会削减不够紧密的前/后两端的胚胎，这是不可能获得正确的图像，因为客观的工作距离，将主要用于集中到果冻，而不是胚胎。

另一个重要的一步成像后期gastrulating胚胎是认真梳理的范围下对准他们感兴趣的阶段时，可能是必要的。通常情况下，胚胎都在上演，根据形态特征，最容易在纵向位置时确认。

可以用这种方法制成的替代修改纳入防褪色剂（如苯二胺或PPD）果冻的第二层，以帮助防止荧光染料漂白。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Glycerin Jelly mounting media		Electron Microscopy Sciences Company	17998-10	Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997.
Zeiss LSM 700 Confocal		Zeiss		The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).
Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT)
Glass microscope slides		Fisher Scientific	12-544-7
Glass cover slips		Electron Microscopy Sciences	72204-02	Size 1 ½ (specific for the objectives used in this work).
Glass cover slips (for making supports)		Fisherfinest	12-544-10	Use four coverslips glued with superglue.
Dissection microscope		M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop	M420
Razor blade				Steel back single edge industrial blades
Spatula		Fisher	21-401-10
Hypodermic needles		Fisher	1482610	26 Gauge
Pipettes		Labnet