评估气孔反应活细菌细胞，采用全叶成像

Summary

我们已经开发出一种简单，重复性的协议来访问气孔反应活的细菌。这种方法最大限度地减少以前相比，使用表皮换肤叶伤人及操纵报告。

Abstract

气孔在植物表皮负责植物室内和环境之间的气体交换的自然开口。他们是由一对保卫细胞，它能够关闭一些外部因素，包括光照强度，二氧化碳的浓度，和相对湿度（RH）的气孔孔径形成。气孔孔径也病原体进入叶子，为疾病的发生发展的关键的一步的主要途径。最近的研究，推出了封闭的孔隙，能有效地减少在拟南芥中的细菌性疾病的发展;植物先天免疫系统的组成部分。在此之前，我们已经使用了表皮剥落评估气孔反应的活细菌（Melotto等人，2006年）;然而维持有利的环境条件对植物表皮的果皮和细菌细胞，已具有挑战性。叶表皮，可以保持活着，健康与MES缓冲液（氯化钾10毫米，25毫米的MES KOH，pH值6.15）保卫细胞的电生理实验。然而，这个缓冲区是不适合获得菌悬液。另一方面，细菌细胞可以保持水是不妥当的长期维持表皮换肤活着。当对水的表皮剥离彩车，在4个小时，暴露在空气干燥的果皮细胞限制时间进行实验。保卫细胞中的一个特定的刺激效果评估的一个理想的方法应该气孔生理和尽可能多的植物自然环境的干扰极小。因此，我们开发出一种新的方法来评估气孔反应活叶伤人及操纵大大降低，旨在提供一个容易复制和可靠的气孔检测细菌。该协议是基于完整的叶与碘化丙啶（PI）染色叶菌悬液的潜伏期，和叶下激光扫描共聚焦显微镜观察染色。最后，此方法允许在同一时间延长期间使用的条件下，紧密地模仿自然条件下，植物病原体攻击，活叶样品的观察。

Protocol

1。植物生长和准备细菌要开始此过程母猪拟南芥种子1:1:1 v：V：V生长介质的混合物（REDI地球插件和幼苗组合，孙格罗），精细的蛭石，和珍珠岩。 成长的植物在生长室（22℃，12小时100μmol/毫米2 /秒的日常光照和65 ± 5％湿度）和水需要。植物是准备在4-6周使用，当他们年轻的完全展开叶前抽薹。 在实验开始前两天准备的细菌培养。甘油对修改后的LB培养基（10克/ L，蛋白胨，5克/ L酵母提取物，5 g / L的NaCl的pH值7.0，和1.5％琼脂）和24小时的孵育28 ° C。股票数假单胞菌丁香使用新鲜的文化准备的接种，总是从甘油股票的培养板作为分培养后变得不那么致命的细菌。 使用细菌，盘上的增长，启动了10毫升的液体文化体育丁香在50 mL锥形瓶中。培养过夜孵育28 ° C剧烈摇晃，直到达到0.8和1之间的600 nm的光密度或外径。 测量外径在600和1360 XG为10分钟，离心收获细胞。重悬的细胞，因此，最后外径为0.2在蒸馏水。此外径10 8集落形成单位（CFU）/ mL的对应。与细菌的准备，着手准备的叶子，并进行检测。 2。叶染色和细菌的孵化为了色斑的叶子先准备20μM的碘化丙啶或PI在水溶液中。 10毫升的溶液是足够的染色时间3小叶子。 检索从生长室和钳分离3年轻，完全展开的叶子的植物。在PI溶液浸泡5分钟整个叶片。然后取出树叶，并用蒸馏水冲洗一下。 下一个叶片具有较低的表面面临载玻片。叶用锋利的刀片切成四大块，不包括中静脉使叶平放在幻灯片上。 孵化与叶中的细菌，添加300μL菌悬液，在幻灯片上的叶件。确保较低的叶表面接触接种。 孵育相同的环境条件下，被用来种植植物的样品。当时在显微镜下观察叶片，叶片转移到一个较低的表面朝上的新幻灯片。注意，安装的幻灯片时，不使用盖玻片。相同的叶样品进行成像孵化过程中多次，根据研究目标，可以设立一个时间过程。 3。显微镜，测量和数据分析在这里，激光扫描共聚焦显微镜（LSM 510 META，卡尔蔡司公司）是用来研究的叶子。观察较低的叶子表面检测PI（激发453 nm，发射543和620 nm）的荧光。 使用相同的树叶样品采集气孔的图像随着时间的推移。保存图像测量气孔的宽度。 测量气孔宽度为每个使用LSM的图像浏览器在每个时间点的治疗至少60个气孔。 气孔宽度计算平均值和标准错误。可以使用2尾，配对聪明的学生的t -检验计算结果的统计意义。 4。气孔反应孵化代表性的图像与细菌这里是一个典型的显微图像（使用20倍的目标）激光下的拟南芥叶表面扫描共聚焦显微镜，在明亮的视场（图1）。 碘化丙啶污渍的增加，除了允许识别数据收集（图2）完好的细胞保卫细胞的知名度的活细胞的细胞壁。可以看出，在这些显微气孔孔径开口，从完全封闭的气孔敞开气孔。 全封闭的气孔保卫细胞的形状（图3）确定。光圈宽度被认为是0微米。 对于开放气孔（图4）显示的光圈宽度测量使用最广泛的气孔孔径面积绘制一条直线横跨。 这些都是典型的实验结果，这个气孔试验。Arabidopis叶假单胞菌丁香有三个不同的菌株，在黑暗中孵育。只有细菌的Pst DC3000能够打开黑暗的封闭气孔，随机选取60％的菌株孔（图5）的光圈宽度测量。 </oL> 图1。 拟南芥的叶子表面的显微照片。叶下激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）使用20倍的目标表面的领域之一。请注意，气孔不资助的荧光，通过碘化丙啶染色（图2）相比，明显。 图2。一个碘化丙啶染色拟南芥叶表面的显微照片 。叶下激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）使用20倍的目标表面的领域之一。注意气孔孔道的开放范围。黄色箭头指出完全关闭气孔和绿色箭头指出敞开气孔。 图3。完全关闭气孔的形状和保卫细胞之间的开放确定 。光圈宽度被认为是0微米。 图4。打开气孔微米孔径的宽度 。测量是使用浏览器基于跨最广泛的气孔孔径地区绘制一条直线的激光共聚焦显微镜。 图5。在实验的时候， 被蒙在鼓里。孵育3株假单胞菌丁香光伏番茄的拟南芥叶片气孔：DC3118，DB29，和DC3000植物。结果显示平均（N = 50-70）±标准误差。双尾学生的t -检验检测统计学意义。实验重复三次类似的结果。

Discussion

我们已经提出了直线前进的程序，以衡量完整的叶片气孔反应不同的治疗方法易于评估的组织气孔。

虽然我们已经介绍了使用的模型系统拟南芥 / 假单胞菌丁香 ，完整的叶片气孔法可以与任何植物细菌组合潜在的执行。该协议可以很容易地进行修改，以适应其他植物和细菌病原体的生长要求。总体原则和程序保持不变。此外，这种方法可能有利于研究人员希望研究保卫细胞，不仅要活的微生物的功能输出，但也给其他刺激和化学药剂的条件下，保持叶片的自然环境。

全叶可由于其厚度不均匀地形的形象很难。删除中旬叶静脉，所以它平放在幻灯片上，使用共聚焦显微镜，可以缓解这个问题。然而，其他类型的荧光显微镜可用于叶面​​获得高分辨率的图像。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Propidium iodide		Sigma Aldrich	P4864
Tryptone		Fisher Scientific	BP1421-1
Yeast Extract		Difco	0127-01-7
Sodium Chloride		VWR	7647-14-5
Agar		Bio Express	J637-2500G
Plant growth chamber
Shaker incubator
Laser scanning confocal microscope