Stomatal रिस्पांस मूल्यांकन लाइव बैक्टीरियल कोशिकाओं पूरी पत्ती इमेजिंग का उपयोग

Summary

हम एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के लिए जीवित बैक्टीरिया stomatal प्रतिक्रिया का उपयोग प्रोटोकॉल विकसित किया है. यह विधि कम से कम लोग घायल हो गए और पत्ती के हेरफेर के रूप में epidermal peels के उपयोग की तुलना में पहले से सूचना दी.

Abstract

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

Protocol

1. बढ़ते संयंत्रों और तैयारी जीवाणु ध्:: v बढ़ माध्यम के मिश्रण (Redi पृथ्वी प्लग और अंकुर मिश्रण, सूर्य Gro), ठीक vermiculite, और perlite इस प्रक्रिया शुरू करने के लिए एक 01:01:01 ध् पर Arabidopsis बीज बोना. एक विकास (22 डिग्री सेल्सियस, 100 μmol / 2 मिमी / सेकंड दैनिक प्रकाश और 65 के 12 घंटे ± 5% नमी) कक्ष और पानी के रूप में की जरूरत में पौधों हो जाओ. पौधों जब वे युवा पूरी तरह से विस्तार पत्ते पेंच करने के लिए पहले 4-6 सप्ताह में उपयोग करने के लिए तैयार हैं. प्रयोग शुरू करने से पहले दो दिनों के जीवाणु संस्कृति तैयार करते हैं. संशोधित लेग मध्यम (10 जी / एल tryptone, 5 ग्राम / एल खमीर निकालने, 5 छ / एल NaCl पीएच 7.0, और 1.5% अगर) और 28 पर 24 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस पर ग्लिसरॉल स्टॉक से स्ट्रीक स्यूडोमोनास syringae ताजा संस्कृति का प्रयोग inoculum तैयार है और हमेशा ग्लिसरॉल शेयरों से संस्कृति प्लेटों शुरू के रूप में बैक्टीरिया कम उप – संवर्धन के बाद उग्र हो जाता है. बैक्टीरिया है कि थाली पर बढ़ी प्रयोग पी. के 10 एमएल तरल संस्कृति शुरू एक 50 एमएल Erlenmeyer फ्लास्क में syringae. संस्कृति 28 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस जोरदार मिलाते हुए जब तक यह 0.8 और 1 के बीच 600 एनएम ऑप्टिकल या घनत्व आयुध डिपो तक पहुँच के साथ. 600 में आयुध डिपो उपाय और 10 मिनट के लिए 1360 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं फसल. आसुत जल में कोशिकाओं को इतना है कि अंतिम ओवर ड्राफ्ट 0.2 है Resuspend. यह आयुध डिपो 10 8 कॉलोनी के गठन इकाइयों (CFU) / एमएल से मेल खाती है है . तैयार बैक्टीरिया के साथ, पत्तियों को तैयार है और परख प्रदर्शन के लिए आगे बढ़ें. 2. पत्ता और जीवाणु के साथ धुंधला ऊष्मायन आदेश में पत्तियों को पहली बार 20 सुक्ष्ममापी propidium आयोडाइड या पानी में PI समाधान तैयार दाग. समाधान के 10 एमएल के एक समय में 3 छोटे पत्ते दाग करने के लिए पर्याप्त है. विकास चैम्बर से और संदंश विच्छिन्न करना के साथ 3 युवा, पूरी तरह से विस्तार पत्ते पौधों पुनर्प्राप्त करें. PI समाधान में 5 मिनट के लिए पूरी पत्तियों को विसर्जित कर दिया. तब पत्ते को हटाने और उन्हें आसुत जल के साथ संक्षिप्त कुल्ला. अगले जगह कम एक खुर्दबीन स्लाइड पर नीचे का सामना करना पड़ सतह के साथ एक पत्ता. चार टुकड़ों में मध्य शिरा को छोड़कर एक तेज धार के साथ इतना है कि पत्ता पत्ता स्लाइड पर फ्लैट देता है कट. पत्तियों के साथ बैक्टीरिया को सेते हैं, स्लाइड पर पत्ती के टुकड़े के तहत जीवाणु निलंबन के 300 μL जोड़ें. सुनिश्चित करें कि पत्ती के निचले सतह inoculum के साथ संपर्क में है. एक ही पर्यावरण की स्थिति है कि पौधों को बढ़ने के लिए इस्तेमाल किया गया के तहत नमूने सेते हैं. खुर्दबीन के नीचे पत्ते निरीक्षण के समय, कम सतह के साथ एक नई स्लाइड सामना करना पड़ रहा पत्ता टुकड़े हस्तांतरण. ध्यान दें कि कवर पर्ची जब स्लाइड्स बढ़ते इस्तेमाल नहीं किया है. वही पत्ता नमूना ऊष्मायन के दौरान कई बार हो imaged कर सकते हैं और एक समय बेशक अनुसंधान उद्देश्यों के अनुसार निर्धारित कर सकते हैं. 3. माइक्रोस्कोपी मापन, और डेटा विश्लेषण यहाँ एक confocal खुर्दबीन स्कैनिंग लेजर (LSM 510 मेटा, कार्ल Zeiss इंक) पत्तियों की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है. पत्तियों के निचले सतह निरीक्षण करने के लिए PI (उत्तेजना 453 एनएम उत्सर्जन 543, और 620 एनएम) के प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए. वही पत्ता नमूने का उपयोग समय पर stomata की छवियों पर कब्जा. Stomatal एपर्चर की चौड़ाई को मापने के लिए छवियों को बचाओ. LSM छवि ब्राउज़र का उपयोग हर बार बिंदु पर प्रत्येक उपचार के लिए कम से कम 60 stomata के stomatal एपर्चर चौड़ाई उपाय. Stomatal एपर्चर चौड़ाई के लिए औसत और मानक त्रुटि की गणना. परिणामों के सांख्यिकीय महत्व 2 पूंछ, बनती बुद्धिमान विद्यार्थी का t-परीक्षण का उपयोग कर परिकलित किया जा सकता है. 4. जीवाणु के साथ ऊष्मायन Stomatal रिस्पांस के प्रतिनिधि छवियाँ यहाँ लेजर के तहत एक Arabidopsis पत्ता सतह उज्ज्वल क्षेत्र दृश्य (चित्रा 1) में confocal खुर्दबीन स्कैनिंग के एक ठेठ सूक्ष्म छवि (एक 20x उद्देश्य का उपयोग) है. Propidium आयोडाइड व्यवहार्य डेटा संग्रह (चित्रा 2) के लिए undamaged कोशिकाओं की पहचान के लिए अनुमति के अलावा में गार्ड कक्षों की दृश्यता बढ़ाने कोशिकाओं के कोशिका दीवार दाग. Stomatal ताकना उद्घाटन की एक सीमा इन micrographs में देखा जा सकता है है पूरी तरह से बंद stomata से खुला stomata. पूरी तरह से बंद stomata गार्ड कोशिकाओं के आकार (चित्रा 3) के द्वारा पहचाने जाते हैं. एपर्चर चौड़ाई 0 सुक्ष्ममापी माना जाता है. खुला stomata (चित्रा 4) के लिए एपर्चर दिखाया चौड़ाई stomatal ताकना के व्यापक क्षेत्र भर में एक सीधी रेखा का उपयोग करके मापा जाता है. इस stomatal परख की ठेठ प्रयोगात्मक परिणाम कर रहे हैं Arabidopis पत्ते. स्यूडोमोनास syringae के तीन अलग अलग उपभेदों के साथ अंधेरे में incubated रहे थे. केवल जीवाणु pst DC3000 अंधेरे बंद stomata, के रूप में बेतरतीब ढंग से चुनी गई बैक्टीरियल तनाव 60 प्रति stomata (चित्रा 5) के एपर्चर चौड़ाई द्वारा मापा खोलने के लिए सक्षम था. </oएल> चित्रा 1. एक Arabidopsis पत्ती की सतह के सूक्ष्मग्राफ लेजर के तहत पत्ती की सतह confocal सूक्ष्मदर्शी (LSCM) 20x उद्देश्य का उपयोग स्कैनिंग के दृश्य का एक क्षेत्र . ध्यान दें कि stomatal एपर्चर के रूप में स्पष्ट नहीं है जब फ्लोरोसेंट propidium आयोडाइड धुंधला (चित्रा 2) के द्वारा सहायता प्राप्त देखने की तुलना में. चित्रा 2. Propidium आयोडाइड से सना हुआ Arabidopsis पत्ती की सतह के सूक्ष्मग्राफ लेजर के तहत पत्ती की सतह confocal सूक्ष्मदर्शी (LSCM) 20x उद्देश्य का उपयोग स्कैनिंग के दृश्य के एक क्षेत्र . Stomatal ताकना खोलने की एक श्रृंखला पर ध्यान दें. पीला तीर पूरी तरह से बंद stomata बताया हैं और हरी तीर खुला stomata की ओर इशारा कर रहे हैं. चित्रा 3. पूरी तरह से करीबी के आकार और गार्ड कोशिकाओं के बीच खोलने के द्वारा की पहचान की stomata एपर्चर चौड़ाई 0 सुक्ष्ममापी माना जाता है . चित्रा 4. ओपन stomata सुक्ष्ममापी में एपर्चर चौड़ाई दिखा. माप LSCM stomatal ताकना के व्यापक क्षेत्र भर में एक सीधी रेखा के आधार पर ब्राउज़र का उपयोग करके ले जाया गया . चित्रा 5. प्रयोग के समय के दौरान. Arabidopsis स्यूडोमोनास syringae pv टमाटर के तीन उपभेदों के साथ incubated पत्तियों के Stomatal एपर्चर: DC3118, DB29, और DC3000 संयंत्रों अंधेरे में रखा गया था. परिणाम मतलब के रूप में दिखाए जाते हैं (n 50-70 =) ± मानक त्रुटि. दो – पुच्छ विद्यार्थी का t-परीक्षण के साथ सांख्यिकीय महत्व का पता चला था. प्रयोग समान परिणामों के साथ तीन बार दोहराया गया था.

Discussion

हम एक सीधे आगे प्रक्रिया बरकरार पत्ता ऊतक में अलग उपचार करने के लिए stomatal प्रतिक्रिया का एक आसान मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है stomatal एपर्चर को मापने प्रस्तुत किया है.

हालांकि हम मॉडल प्रणाली Arabidopsis / स्यूडोमोनास syringae का उपयोग कर परिणाम प्रस्तुत किया है, बरकरार पत्ता stomatal परख संभावित संयंत्र जीवाणु किसी भी संयोजन के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है. प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य पौधों और बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के विकास आवश्यकताओं को फिट करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. समग्र सिद्धांत और प्रक्रिया ही रहते हैं. इसके अलावा, इस विधि शोधकर्ताओं ने गार्ड न केवल कोशिकाओं को रोगाणुओं जीने के कार्यात्मक उत्पादन का अध्ययन करना चाहते हैं के लिए फायदेमंद हो सकता है, लेकिन हो सकता है अन्य उत्तेजनाओं और शर्तों के तहत रासायनिक एजेंट है कि पत्ती के प्राकृतिक वातावरण बनाए रखने के लिए भी.

पूरी पत्ती इसकी मोटाई और असमान स्थलाकृति के कारण छवि के लिए मुश्किल हो सकता है. यह समस्या पत्ती के मध्य नस को हटाने तो यह स्लाइड पर फ्लैट देता है और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग द्वारा alleviated किया जा सकता है. हालांकि, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के अन्य प्रकार पत्ती की सतह की उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Propidium iodide		Sigma Aldrich	P4864
Tryptone		Fisher Scientific	BP1421-1
Yeast Extract		Difco	0127-01-7
Sodium Chloride		VWR	7647-14-5
Agar		Bio Express	J637-2500G
Plant growth chamber
Shaker incubator
Laser scanning confocal microscope