Сотовые к клетке высокомолекулярных транспорта Пробирной В Планта Используя Biolistic Бомбардировка
Summary
Высокомолекулярных торговли между растительных клеток можно оценить с помощью выражения временно флуоресцентно с метками белок и анализ его внутри-и межклеточных распределение по конфокальной микроскопии.
Abstract
Здесь мы приведем простой и быстрый протокол для обнаружения и оценки степени клетка-клетка макромолекулярного транспорта в подошвы. В этом протоколе флуоресцентно меченых белков интереса временно выражается в растительной ткани следующие biolistic доставки его ДНК, кодирующей конструкции. Внутри-и межклеточных распределения меченых белков затем анализируется с помощью конфокальной микроскопии. Мы описываем эту технологию в деталях, предоставление шаг за шагом, протоколы анализа и оценки степени symplastic транспортного белка в трех видов растений Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana и Н. Tabacum (табак).
Protocol
Discussion
Ключ для успеха symplastic анализа транспорт для получения высокой эффективности преобразования, что позволяет выпускать статистически значимое и легко поддающийся обнаружению кластеров сигнала. Это может быть достигнуто с помощью листьев собранных от здоровых, надежных растений, а такж…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Наша работа поддержана грантами NIH / NIGMS, NSF, USDA / НИФА и BARD к ВК.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Gold microparticles, 1.0 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2262 | ||
| Gold microparticles, 0.6 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2263 | ||
| Spermidine | Sigma | S0266-1G | ||
| Tefzel tubing | Bio-Rad | 165-2441 | ||
| Helios cartridge preparatory station | Bio-Rad | 165-2420 | ||
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | ||
| Helios gene gun | Bio-Rad | 165-2432 | ||
| Helium gas regulator | Bio-Rad | 165-2413 |
References
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. . Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
- Lucas, W. J. Plant viral movement proteins: agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes. Virology. 344, 169-184 (2006).
- Epel, B. L. Plant viruses spread by diffusion on ER-associated movement-protein-rafts through plasmodesmata gated by viral induced host beta-1,3-glucanases. Semin Cell Dev Biol. 20, 1074-1081 (2009).
- Zambryski, P. C., Crawford, K. Plasmodesmata: gatekeepers for cell-to-cell transport of developmental signals in plants. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 393-421 (2000).
- Rivero-Lepinckas, L., Crist, D., Scholl, R. Growth of plants and presercation of seeds. Methods Mol Biol. 323, 3-12 (2006).
- Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat Protoc. 4, 71-77 (2009).
- Oparka, K. J. Simple, but not branched, plasmodesmata allow the nonspecific trafficking of proteins in developing tobacco leaves. Cell. 97, 743-754 (1999).
- Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues. Plant Cell. 11, 309-322 (1999).
- Gisel, A., Barella, S., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. Temporal and spatial regulation of symplastic trafficking during development in Arabidopsis thaliana apices. Development. 126, 1879-1889 (1999).
- Kim, I., Cho, E., Crawford, K. M., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. Cell-to-cell movement of GFP during embryogenesis and early seedling development in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 2227-2231 (2005).
- Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
- Roberts, A. G. Phloem unloading in sink leaves of Nicotiana benthamiana: comparison of a fluorescent solute with a fluorescent virus. Plant Cell. 9, 1381-1396 (1997).
- Guenoune-Gelbart, D., Elbaum, M., Sagi, G., Levy, A., Epel, B. L. Tobacco mosaic virus (TMV) replicase and movement protein function synergistically in facilitating TMV spread by lateral diffusion in the plasmodesmal desmotubule of Nicotiana benthamiana. Mol Plant Microbe Interact. 21, 335-345 (2008).
