Una cellula-cellula Macromolecole saggio di trasporto In Planta Utilizzando Bombardamento Biolistic
Summary
Traffico macromolecolari tra le cellule delle piante può essere valutata transitoriamente esprimere una proteina fluorescente-tagged di interesse e per analizzarne la distribuzione intra-ed intercellulare mediante microscopia confocale.
Abstract
Qui, vi presentiamo un protocollo semplice e rapido per rilevare e valutare l'entità del cellula-cellula trasporto macromolecolari in planta. In questo protocollo, una fluorescente con tag proteina di interesse è transitoriamente espressa in tessuti vegetali dopo la consegna biolistic del suo DNA codifica costruire. La distribuzione intra-ed intercellulare della proteina tag viene quindi analizzato al microscopio confocale. Descriviamo questa tecnologia nel dettaglio, fornendo passo-passo protocolli di saggiare e valutare l'entità del trasporto delle proteine symplastic in tre specie di piante, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana e N. tabacum (tabacco).
Protocol
Discussion
La chiave per il successo del saggio di trasporto symplastic è quello di ottenere elevata efficienza di trasformazione, che consente la produzione di cluster segnale statisticamente significativi e facilmente misurabili. Ciò può essere ottenuto utilizzando le foglie raccolte da piante sane, robuste, e la preparazione di particelle di oro rivestite da una preparazione del DNA puro e concentrato.
Utilizzando le foglie in fase di crescita stessa è fondamentale anche per l'affidabilità …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il nostro lavoro è supportato anche da finanziamenti NIH / NIGMS, NSF, USDA / NIFA e BARD a VC.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Gold microparticles, 1.0 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2262 | ||
| Gold microparticles, 0.6 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2263 | ||
| Spermidine | Sigma | S0266-1G | ||
| Tefzel tubing | Bio-Rad | 165-2441 | ||
| Helios cartridge preparatory station | Bio-Rad | 165-2420 | ||
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | ||
| Helios gene gun | Bio-Rad | 165-2432 | ||
| Helium gas regulator | Bio-Rad | 165-2413 |
References
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