Isolamento de Células-Tronco da retina do olho do rato

Summary

Neste vídeo, vamos demonstrar como isolar células-tronco na retina do epitélio ciliar do olho do rato e cultivá-las em cultura para dar forma clonal esferas da retina. As esferas que estão isolados possuem as propriedades cardeal de células-tronco: a auto-renovação e multipotencialidade.

Abstract

O adulto do rato com células-tronco da retina (RSC) é uma célula quiescente rara encontrada no epitélio ciliar (CE) do olho de mamífero ^1,2,3. A CE é composta por não-pigmentada interior e camadas de células pigmentadas exterior, e as colônias clonais RSC que surgem a partir de uma única célula pigmentada da CE são feitas de ambas as células pigmentadas e não pigmentadas que podem ser diferenciadas para formar todos os tipos de células da retina neural e RPE. Existe alguma controvérsia sobre se todas as células dentro das esferas contêm pelo menos cerca de ⁴ pigmento, porém as células ainda são capazes de formar os diferentes tipos de células encontradas na retina neural ^1-3. Em algumas espécies, como anfíbios e peixes, seus olhos são capazes de regeneração após a lesão ^5, no entanto, o olho dos mamíferos não mostra tais propriedades regenerativas. Procuramos identificar as células-tronco in vivo e para compreender os mecanismos que mantêm a retina de mamíferos as células-tronco quiescentes ^08/06, mesmo após a lesão, bem como usá-los como uma fonte potencial de células para ajudar a reparar os modelos físico ou genético de lesão ocular através do transplante ^9-12. Aqui nós descrevemos como isolar as células ciliares do epitélio do olho do rato e cultivá-las em cultura, a fim de formar a esferas clonal das células da retina-tronco. Como não existem marcadores conhecidos da célula-tronco in vivo, estas esferas são a única maneira conhecida para prospectivamente identificar a população de células-tronco dentro do epitélio ciliar do olho.

Protocol

1. Preparar as soluções Dissecting e soluções enzimáticas Faça o fluido cerebral Artificial Spinal (ACSF) eo soro de mídia livre antes do tempo e leve à geladeira. Pesar o ácido cinurênico (0,2 mg / mL) e dissolver em 10 mL de hilo ACSF em um banho-maria 37 ° C antes do tempo, uma vez que não se dissolve prontamente. Pesar a tripsina (1,33 mg / mL) e hialuronidase (0,67 mg / mL) e coloque em um tubo de 15 mL e mantê-lo a -20 ° C até ser necessário. Adicionar a solução de ácido cinurênico a este tubo e filtrar através de um filtro de seringa de 22 M apenas antes de usar. Pesar inibidor de tripsina (Ovamucoid: 1 mg / mL) e dissolver em água morna soro livre de Mídia e filtro com filtro de seringa de 22μm. Fazer a media chapeamento: Soro sem mídia contendo FGF2 (10 ng / mL) e heparina (2 mg / mL). 2. Isolar células estaminais da retina do olho do rato Isolamento das células-tronco da retina é realizado em uma sala específica estéril dedicada a experimentos de cultura primária. Antes de iniciar este procedimento, configure o microscópio de dissecação e de luz fria de origem e, em seguida, estabelecer os instrumentos estéreis de dissecação. Cada capa tem um esterilizador quente talão para a esterilização dos instrumentos entre as etapas. Vamos isolar células-tronco na retina dos olhos que foram colocados imediatamente em uma placa de Petri estéreis, contendo Fluid Cerebral Artificial Spinal (ACSF) após a sua retirada de camundongos sacrificados de acordo com a ética protocolos animais aprovados. Sob o microscópio de dissecação, limpar o olho com uma pinça: livrar-se do cabelo e do tecido conjuntivo que é anexado à córnea / border escleral. Em seguida, transferir o olho a um novo prato com ACSF. Enquanto delicadamente segurando o olho parado com uma pinça serrilhada, use ângulo micro-dissecando tesouras para remover os músculos oculares. Remover o nervo óptico, bem como se ele ainda está ligado ao olho. Tente não esmagar o olho durante este processo. Transferência de olhos para um novo prato com ACSF. Use próxima curva micro-dissecando tesoura para cortar o olho ao meio: começar no nervo óptico e passou no meio da córnea, reunião de volta ao nervo óptico onde o corte foi iniciado. O ideal é que as duas partes do olho são aproximadamente equivalentes em tamanho, porque isso vai dar o próximo passo mais fácil. Segurando as córneas utilizando duas pinças, descascar delicadamente o olho duas metades separadas. Remova e descarte a lente, vísceras, ea retina neural das conchas dos olhos. Transferir as cascas para um novo prato com ACSF. Agora estamos prontos para isolar o epitélio ciliar. Para começar, orientar shell o olho para que a córnea está à sua direita eo epitélio pigmentado da retina (EPR) é à esquerda. Suavemente o pino shell olho para baixo com uma pinça reta do lado RPE. Em seguida, use um bisturi para cortar a córnea ea íris longe do epitélio ciliar do olho empurrando levemente para baixo sobre o bisturi ao invés de usar movimentos de corte. Depois disso, corte o epitélio ciliar longe do RPE. Uso não-serrilhada fórceps para transferir a faixa de epitélio ciliar de um prato de 35 mm contendo novas ACSF. Da mesma forma, isolar o epitélio ciliar da shell outro olho. Uma vez que ambas as tiras ciliar epiteliais foram recolhidos, transferir as tiras em um prato de 35 mm contendo 2 ml de Dispase. Coloque o prato com as tiras em uma incubadora de 37 ° C por 10 minutos. Após 10 minutos, transferir as faixas a partir do Dispase em um prato contendo 2 ml de tripsina filtrado, hialuronidase e ácido cinurênico. Coloque o prato a 37 ° C por 10 minutos. Agora retorne ao microscópio de dissecação. Enquanto mantém a esclera para baixo com uma pinça reta, use a parte inferior da curva não-serrilhada pinça para delicadamente raspar o epitélio ciliar longe da esclera. Remova a esclera do prato. Tudo o que deve ser deixado no prato agora são as células de interesse e da solução enzimática. Usando um fogo-polido algodão ligado de pipeta, transferir essa solução para um tubo de 14 ml. Triturar esta solução 30 vezes para quebrar as células epiteliais delicadamente forçando a solução dentro e fora da pipeta. Centrifugar o tubo por 5 minutos a 1500 RPM. Quando a centrifugação estiver pronto, retire o tubo da centrífuga cuidadosamente vez que as células são propensas a saindo do fundo do tubo nesta fase. Aspirar cuidadosamente a maioria do sobrenadante com uma pipeta-fogo polido, e em seguida, adicione 1 mL de inibidor de tripsina em soro livre de mídia para as células. Use um pequeno furo de algodão ligado de pipeta para triturar a amostra de cerca de 50 vezes até que é uma suspensão de uma única célula. Centrifugar o tubo novamente por 5 minutos a 1500 RPM. Remover o sobrenadante e substituí-la por 1 mL de seu meio de placas. Triturar delicadamente usando uma pipeta de vidro polido-fogo para ressuspender as células. Depois que a contagemção das células da placa, eles na densidade desejada em uma placa de 24 cavidades. Nós placa geralmente 10 células / microlitro, preenchendo cada cavidade primeiro com o meio e depois da adição da suspensão celular para obter um volume final de 500 mL de mídia. Coloque a placa em um 37 ° C incubadora de CO 2, onde não será movido até você contar as esferas que surgem após 7 dias. 3. Resultados de isolamento de células-tronco da retina Quando este procedimento é realizado com sucesso, o dissecados ciliar células epiteliais deve ficar assim depois de ter sido dissociadas e banhado em baixa densidade (Figura 1). Após 7 dias em cultura, as esferas de células-tronco da retina que surgem são contados. A esfera deve ser superior a 75 m de diâmetro e livre-flutuante para ser contada como uma célula-tronco derivadas esfera. (Figura 2). No entanto, algumas células terão esferóides limitada proliferação e de formulário que não atender critério de tamanho e não será contado como esferas de células-tronco derivadas; um exemplo de um esferóide como é mostrado aqui (Figura 2). 4. Resultados representante Figura 1. Figura 2.

Discussion

Este protocolo descreve como isolar células-tronco na retina do epitélio ciliar do mouse ocular ^1-3. A metodologia para isolar as tiras de epitélio ciliar pode variar, no entanto as enzimas e metodologia para alcançar uma suspensão de uma única célula foram otimizados neste protocolo. Também é importante que as tiras do epitélio ciliar que foram isolados não contêm grandes quantidades de RPE ou córnea uma vez que estes parecem ter um impacto negativo sobre o número total de esferas que podem ser isoladas de cada olho. Além disso, os meios de comunicação sem soro que fazemos que foi originalmente formulado para o cérebro neurospheres ^13, é ideal para o cultivo de células da retina esferas tronco. Deve-se também certificar-se que as células não sejam perturbados depois de terem sido banhado e colocado na incubadora para que as esferas de crescimento não se agregam em conjunto ^14.

Uma vez que as células-tronco da retina formaram esferas clonal, que pode ser contado para obter um número potencial de células-tronco por olho. As esferas, em seguida, pode ser dissociada em células individuais e várias passagens para verificar auto-renovação ou capacidades diferenciadas em diferentes tipos de células da retina neural e RPE usando diferentes combinações de fatores de crescimento e / ou proteínas.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Stemi 2000 Microscope		Zeiss
Cold Light Source		Zeiss	KL1500	dual arm optic light
Curved Mini Vannas scissors		FST	15000-10
Angled Vannas scissors		FST	15005-08
#7 Dumont forceps		FST	11272-30	non-serrated
#5 Dumont forceps		FST	11251-10	straight
Fine forceps		FST	11051-10	serrated curved
#3 Scalpel handle		Almedic	2586-M36-10
#10 Scalpel blades		Almedic	2580-M90-10
Hot Bead Sterilizer		FST	18000-45
Dispase		VWR/BD	CACB354235
Trypsin		Sigma	T1005
Hyaluronidase		Sigma	H6254
Kynurenic Acid		Sigma	K3375	1000 IU
Trypsin Inhibitor		Roche	10109878001
35 mm dishes		VWR/Nunc	CA354235
24-well plate		VWR/Nunc	CA73521-004
Cotton-plugged pipettes		VWR	14672-400	fire-polish
14 mL Tubes		Falcon	352057	Polystyrene
Serum-free Media				Ref# 13 for formulation
FGF2		Sigma	F0291
Heparin		Sigma	H3149	100 IU