Визуализация УФ-индуцированной репликации промежуточных Е. палочки Использование двумерных агарозном гель-анализа
Summary
Мы представляем процедура, посредством которой двумерной агарозном гель-анализ может быть использован для определения структуры репликации промежуточных, которые происходят следующие УФ-облучения.
Abstract
Неточный репликации в присутствии ДНК является причиной большинства сотовых перестановок и мутагенеза наблюдается во всех типах клеток, и многие считают, непосредственно связанные с развитием рака у людей. Повреждение ДНК, как, например, индуцированной УФ-излучением, сильно снижает способность репликации дублировать геномной шаблон точно. Ряд продуктов генов были идентифицированы, которые необходимы при репликации встреч повреждений ДНК в шаблоне. Тем не менее, остающиеся проблемы в том, чтобы определить, как эти повреждения белков процесс во время репликации<em> В естественных условиях</em>. Использование кишечной палочки в качестве модельной системы, мы опишем процедуру, в которой двумерная агарозном гель-анализ может быть использован для выявления структурных промежуточных, которые возникают на репликацию плазмид<em> В естественных условиях</em> Следующий УФ-индуцированного повреждения ДНК. Эта процедура была использована, чтобы продемонстрировать, что репликация вилки заблокирован УФ-индуцированного повреждения пройти переходный разворота, которая стабилизируется RecA и нескольких продуктов гена, связанного с пути RecF. Техника показывает, что эти промежуточные репликации, сохраняются до времени, что коррелирует с удалением от поражения нуклеотидных репарации и репликации возобновляется.
Protocol
Discussion
Типичные результаты, полученные от дикого типа клетки в присутствии и в отсутствие УФ-индуцированного повреждения показаны на рисунке 1. При отсутствии повреждений, ~ 1% от общей плазмидной ДНК можно найти в дуге Y, когда клетки быстро растут в экспоненциальной фазе. После облучения, прех…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа в нашей лаборатории проводится при поддержке КАРЬЕРА награду MCB0551798 от Национального научного фонда и грант ОБЛАСТЬ R15GM86839 от NIGMS-NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE | G15T8 | Yellow Lighting | |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp | |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer | |
| 0.025 μm pore disks | Whatman | VSWP04700 | Floating dialysis disks | |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease | |
| Nick-translation kit | Roche Diagnostics | 976776 | To make 32P-labeled probe | |
| Blotting Paper | Whatman | 3030-704 | For Southern transfer | |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
- Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli. Science. 299, 1064-1067 (2003).
- Friedman, K. L., Brewer, B. J. Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).
- Spivak, G., Hanawalt, P. C. Determination of damage and repair in specific DNA sequences. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning – A laboratory manual. , (2001).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli. J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli. Genetics. 166, 1631-1640 (2004).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli. J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).
- Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest. J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli. Radiat Res. 168, 499-506 (2007).
- Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions. Mutat Res. 645, 19-26 (2008).
