تصور الوسطيات المتماثل للأشعة فوق البنفسجية يتسبب في E. القولونية ثنائي الأبعاد باستخدام Agarose جل التحليل
Summary
نقدم الإجراء الذي يمكن أن تستخدم ثنائي الأبعاد agarose هلام تحليل لتحديد هيكل وسيطة النسخ التالية التي تحدث للاشعة فوق البنفسجية.
Abstract
النسخ غير دقيقة في وجود الحمض النووي من التلف هي المسؤولة عن غالبية إعادة ترتيب الخلوية والطفرات التي لوحظت في جميع أنواع الخلايا ، ويعتقد على نطاق واسع لتكون مرتبطة مباشرة مع تطور السرطان لدى البشر. الحمض النووي من التلف ، مثل تلك التي تسببها أشعة فوق البنفسجية ، ويضعف بشدة قدرة تكرار لتكرار قالب الجينومية بدقة. وقد تم تحديد عدد من المنتجات التي يتم الجينات المطلوبة عند تكرار اللقاءات آفات الحمض النووي في القالب. ومع ذلك ، فقد كان التحدي المتبقية لتحديد كيفية معالجة هذه الآفات البروتينات أثناء النسخ المتماثل<em> في الجسم الحي</em>. باستخدام القولونية كنظام النموذج ، فإننا وصف الإجراء الذي يمكن أن تستخدم ثنائي الأبعاد agarose هلام التحليل من أجل تحديد وسيطة الهيكلية التي تنشأ عن تكرار البلازميدات<em> في الجسم الحي</em> التالي الأشعة فوق البنفسجية التي يسببها تلف الحمض النووي. وقد استخدم هذا الإجراء لإثبات أن تتفرع تكرار حظره بواسطة الأشعة فوق البنفسجية التي يسببها الضرر الخضوع لانعكاس عابر أن استقرت RecA والمنتجات الجينات المرتبطة عدة المسار RecF. أسلوب يدل على أن تتم المحافظة على هذه سيطة النسخ المتماثل حتى الوقت الذي يرتبط مع إزالة الآفات إصلاح الختان النوكليوتيدات واستئناف النسخ المتماثل.
Protocol
Discussion
وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها من خلايا نموذجية النوع البري في حضور وغياب الأشعة فوق البنفسجية التي يسببها تلف في الشكل 1. في غياب أي ضرر ، ويمكن العثور ~ 1 ٪ من الحمض النووي للبلازميد الإجمالي في قوس Y عندما الخلايا تنمو بسرعة في مرحلة الأسي. بعد التشعيع ، لوحظ زياد?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم العمل في المختبر لدينا من قبل جائزة التوظيف MCB0551798 من المؤسسة الوطنية للعلوم ومنطقة منحة R15GM86839 من NIGMS – NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE | G15T8 | Yellow Lighting | |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp | |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer | |
| 0.025 μm pore disks | Whatman | VSWP04700 | Floating dialysis disks | |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease | |
| Nick-translation kit | Roche Diagnostics | 976776 | To make 32P-labeled probe | |
| Blotting Paper | Whatman | 3030-704 | For Southern transfer | |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
- Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli. Science. 299, 1064-1067 (2003).
- Friedman, K. L., Brewer, B. J. Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).
- Spivak, G., Hanawalt, P. C. Determination of damage and repair in specific DNA sequences. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning – A laboratory manual. , (2001).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli. J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli. Genetics. 166, 1631-1640 (2004).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli. J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).
- Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest. J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli. Radiat Res. 168, 499-506 (2007).
- Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions. Mutat Res. 645, 19-26 (2008).
