In vivo Kvantifiering av G Tillsammans Interaktioner protein receptor med spektralt korrigerats inom två-photon Mikroskopi
Summary
Genom att använda ett spektralt löst två-photon-systemet mikroskopi avbildning, är pixelnivå kartor över Förster Resonance Energy Transfer (FRET) effektivitetsvinster för celler som uttrycker membranreceptorer hypoteser för att bilda homo-oligomeric komplex. Från FRET effektivitet kartor, kan vi uppskatta stökiometriska information om oligomer komplex under utredning.
Abstract
Studien av protein interaktioner i levande celler är ett viktigt forskningsområde eftersom informationen samlats både fördelar industriella applikationer samt ökar grundläggande grundläggande biologisk kunskap. Förster (fluorescens) Resonance Energy Transfer (FRET) mellan en givare molekyl i ett elektroniskt exciterat tillstånd och en närliggande acceptor molekyl har ofta använts för studier av protein-protein interaktioner i levande celler. De proteiner av intresse är märkta med två olika typer av fluorescerande prober och uttryckt i biologiska celler. Den fluorescerande prober är då glada, oftast med hjälp av laserljus och spektrala egenskaper fluorescens utsläpp som härrör från den fluorescerande prober samlas in och analyseras. Information om graden av proteininteraktioner är inbäddad i den spektrala utsläppsdata. Normalt måste cellen ska skannas flera gånger för att samla tillräckligt spektrala informationen för att korrekt kvantifiera omfattningen av proteininteraktioner för varje region av intresse i cellen. Däremot kan den molekylära sammansättningen av dessa områden förändras under loppet av förvärvsprocessen, vilket begränsar den rumsliga bestämning av kvantitativa värden uppenbara FRET effektivitetsvinster ett genomsnitt över hela celler. Med hjälp av ett spektralt löst två-photon mikroskop, kan vi få en full uppsättning av spektralt lösas bilder efter bara en komplett excitation skanning av provet av intresse. Från denna pixelnivå spektrala data, en karta över FRET effektivitet i hela cellen beräknas. Genom att tillämpa en enkel teori om FRET i oligomeric komplex till experimentellt erhållna fördelningen av FRET effektivitet i hela cellen, avslöjar en enda spektralt lösas skanna stökiometriska och strukturell information om oligomer komplex under utredning. Här beskriver vi proceduren att förbereda biologiska celler (jästsvampen Saccharomyces cerevisiae) som uttrycker membran receptorer (sterila 2 α-faktor-receptorer) märkta med två olika typer av fluorescerande prober. Dessutom visar vi kritiska faktorer som samlar fluorescens data med hjälp av spektral löst två-photon-systemet mikroskopi avbildning. Användningen av detta protokoll kan utvidgas för att studera någon typ av protein som kan uttryckas i en levande cell med en fluorescerande markör fäst vid den.
Protocol
Discussion
I denna presentation illustrerade vi hur man bestämma storlek och strukturell information om ett protein oligomerer komplex in vivo. Medan de presenterade data från en särskild membran receptor (dvs Ste2p) uttryckt i jästceller, är metoden allomfattande i det att den kan appliceras på alla typer av proteiner som uttrycks i någon typ av celler, den enda bestämmelse är att de proteiner är taggade med lämplig fluorescerande markörer. Framtida ändringar av detta protokoll kommer att innebära ökad ins…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av UW-Milwaukee Forskning tillväxtinitiativet, Wisconsin Institutet för biomedicin och hälsa Technologies, och Bradley Foundation.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | ||
| Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | ||
| Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | ||
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma Aldrich | Y2001 | ||
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | ||
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | ||
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | ||
| Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | ||
| Leucine | Fisher Scientific | BP385 | ||
| Histidine | Fisher Scientific | BP382 | ||
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon | |||
| Spectrally resolved two photon microscope |
References
- Raicu, V., Diaspro, A. . Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy. , (2010).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Raicu, V., Popescu, A. . Integrated Molecular and Cellular Biophysics. , (2008).
- Selvin, P. R. The renaissance of fluorescence resonance energy transfer. Nat Struct Biol. 7, 730-734 (2000).
- Raicu, V., Jansma, D. B., Miller, R. J., Friesen, J. D. Protein interaction quantified in vivo by spectrally resolved fluorescence resonance energy transfer. Biochem J. 385, 265-277 (2005).
- Maurel, D. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nat Methods. 5, 561-567 (2008).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 151-156 (2008).
- Demarco, I. A., Periasamy, A., Booker, C. F., Day, R. N. Monitoring dynamic protein interactions with photoquenching FRET. Nat Methods. 3, 519-524 (2006).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16, 19-27 (2005).
- Wlodarczyk, J. Analysis of FRET signals in the presence of free donors and acceptors. Biophys J. 94, 986-1000 (2008).
- Förster, T. Experimentelle und theoretische Untersuchung des zwischenmolekularen bergangs von Elektronenanregungsenergie. Z. Naturforsch. A: Astrophys Phys Phys Chem. 4, 321-321 (1949).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-2124 (2006).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
- Raicu, V. Efficiency of Resonance Energy Transfer in Homo-Oloigomeric Complexes of Proteins. J Biol Phys. 33, 109-127 (2007).
- Raicu, V., Fung, R., Melnichuk, M., Chaturvedi, A. . , (2007).
- Raicu, V. Determination of supramolecular structure and spatial distribution of protein complexes in living cells. Nat Photonics. 3, 107-113 (2009).
- Rath, S., Sullivan, A. P., Stoneman, M. R., Raicu, V. Microspectroscopic method for determination of size and distribution of protein complexes in vivo. Proc of SPIE. 7378, 737829-737829 (2009).
- Kurjan, J. Pheromone response in yeast. Annu Rev Biochem. 61, 1097-1129 (1992).
- Overton, M. C., Chinault, S. L., Blumer, K. J. Oligomerization of G-protein-coupled receptors: lessons from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 4, 1963-1970 (2005).
