उप सेलुलर संकल्प पर बरकरार ड्रोसोफिला लार्वा के vivo इमेजिंग में

Summary

इस प्रोटोकॉल और बरकरार anesthetization इमेजिंग के लिए एक विश्वसनीय विधि का वर्णन<em> ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em> लार्वा. हम अस्थिर desflurane संवेदनाहारी को कुछ दिनों के लिए लिए उप सेलुलर और संरचनाओं की फिर से पहचान संकल्प दोहराए इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए उपयोग किया है¹.

Abstract

ऑप्टिकल इमेजिंग, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorophores और आनुवंशिक उपकरणों में हाल ही के सुधार वांछित ट्रांसजेनिक जानवर लाइनों के कुशल स्थापना की अनुमति एक जीने के संदर्भ में जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए सक्षम है, और कुछ मामलों में भी बर्ताव, जीव. हम इस प्रोटोकॉल का वर्णन करेंगे कैसे बरकरार ड्रोसोफिला लार्वा, अस्थिर desflurane, चतनाशून्य करनेवाली औषधि का उपयोग करने के लिए विकास और उप सेलुलर ^{संकल्प} 1-3 synaptic आबादी के plasticity का पालन anesthetize. जबकि अन्य उपयोगी तरीकों ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा anesthetize पहले किया गया है ^4,5,6,7,8 वर्णित है, इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण निम्नलिखित संयुक्त प्रमुख विशेषताओं की वजह से सुधार दर्शाता है: (1) anesthetization की एक बहुत ही उच्च स्तर, भी दिल की धड़कन 150 ¹ एनएम के पार्श्व संकल्प के लिए अनुमति गिरफ्तार, (2)> anesthetization चक्र के अनुसार 90% के एक उच्च जीवित रहने की दर, घंटे की अवधि ^से अधिक 2 दिन और (अधिक से अधिक पाँच समय अंक की रिकॉर्डिंग की अनुमति 3) एक उच्च 2 मामलों में हमें सक्षम करने संवेदनशीलता शारीरिक स्तर पर व्यक्त प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए. विस्तार में, हम postsynaptic ग्लूटामेट रिसेप्टर सबयूनिट GluR – आईआईए स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों में अंतर्जात ¹ प्रमोटर और एक्सॉन जाल लाइन ¹ FasII – GFP के माध्यम से व्यक्त की कल्पना करने में सक्षम थे. (4) ^4,7 लार्वा अन्य तरीकों के विपरीत न केवल जीवित imaged किया जा सकता है, लेकिन यह भी बरकरार (यानी गैर dissected) अवलोकन ¹ दिन के एक नंबर पर होने के लिए अनुमति देता है. साथ वीडियो विवरण के अलग अलग हिस्सों के vivo इमेजिंग ^2,3 कक्ष में समारोह, लार्वा, anesthetization प्रक्रिया, कैसे लार्वा के भीतर विशिष्ट पदों को फिर से पहचान और लार्वा के सुरक्षित हटाने के बढ़ते सही इमेजिंग से चैम्बर.

Protocol

ए) इमेजिंग कक्ष की सभा चुना मंच (जैसे जल्दी 3 Rd instar 25 के बारे में 24 घंटे की एक अवलोकन अंतराल छोड़ने ° सी लार्वा चरण भटक तक) के लार्वा का चयन करें. कुल्ला पानी के साथ लार्वा संस्कृति मध्यम और इसे सूखा थपका साफ. कोट कक्ष के नीचे तत्व, लार्वा चेहरा क्षेत्र की हेलोकार्बन तेल की एक पतली फिल्म के साथ, बीच. उदर कक्ष में खुर्दबीन उद्देश्य का सामना करना पड़ पक्ष के साथ लार्वा रखो (neuromuscular जंक्शन (NMJ) 26 और 27 imaged किया जा करने की अनुमति देता है) (चित्रा 1 एई). तेल की परत पर प्लास्टिक स्पेसर ग्रिड चेहरा ऊपर (चित्र 1 ए) की हवा स्लॉट के साथ, प्लेस. इस कदम पर सत्यापित करें: स्पेसर की ऊंचाई लगभग आधा लार्वा व्यास, भट्ठा की चौड़ाई लार्वा के व्यास के बारे में दो बार होना चाहिए. खुर्दबीन पर इमेजिंग कक्ष निकालें. बी) के लार्वा के Anesthetization चैम्बर के दो inlets एक उपयुक्त anesthetization / डिवाइस vaporizer के साथ कनेक्ट. अप सामने की पुष्टि करें: कमरे हवा में desflurane प्रभावी एकाग्रता सुरक्षा नियमों द्वारा निर्दिष्ट है कि कभी नहीं होनी चाहिए! केवल एक बहुत छोटे desflurane की कुल मात्रा के लार्वा anesthetize की जरूरत है. 1 desflurane के 15% (v / v) आवेदन के लिए आदर्श के लिए एक प्रयोग में इस्तेमाल किया जा एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु साबित हो गया है. हम सुरक्षा कारणों के लिए सुझाव है कि vaporizer अधिक desflurane कभी नहीं होते हैं की तुलना में vivo इमेजिंग में 2-4 घंटे के लिए की जरूरत है. एक गिलास पानी में चैम्बर के आउटलेट से जुड़ी ट्यूब के दूसरे छोर विसर्जित तब के बारे में पाँच सेकंड के लिए चैम्बर में संवेदनाहारी के प्रवाह को नियंत्रित वाल्व खोलने के. इस कदम पर सत्यापित करें: हवाई बुलबुले पानी में चढ़ा? यदि नहीं, तो कक्ष टपका हुआ है. के बारे में तीन सेकंड के लिए वाल्व बंद करें. माइक्रोस्कोप में अवशिष्ट लार्वा आंदोलनों मॉनिटर. दोनों के दिल की धड़कन और मांसपेशी आंदोलनों की जाँच करें. यदि आवश्यक हो खुले और बंद वाल्व के रूप में चरण 8 और 9 में वर्णित लार्वा की anesthetization जब तक पूरा हो गया है, तो सभी वाल्व बंद और इमेजिंग शुरू. इस कदम पर सत्यापित करें: अवशिष्ट मांसपेशी आंदोलन या दिल की धड़कन को इंगित करता है कि लार्वा ठीक anesthetized नहीं है. पूरा anesthetization उच्च संकल्प छवियों के लिए महत्वपूर्ण है. लार्वा एक निश्चित समय पर आम तौर पर अब से 15-20 मिनट के लिए नहीं किया जाना चाहिए anesthetized. सी) इमेजिंग सही स्थिति और ब्याज की संरचना (2-4 चित्रा) की छवि को पहचानें. Anesthetization से) रिकवरी बाद इमेजिंग पूरा हो गया है चैम्बर में हवा चलो. इस कदम पर सत्यापित करें: प्रेषित हलोजन प्रकाश द्वारा लार्वा के दिल की धड़कन और मांसपेशी संकुचन की जाँच करें. के रूप में की मांसपेशियों को करार शुरू इमेजिंग चैम्बर से लार्वा को दूर करने के लिए सुरक्षित है. Anesthetization डिवाइस से अलग कक्ष और यह खुर्दबीन से हटायें. चैम्बर ध्यान से अलग करना और मैश किए हुए मक्खी खेती मध्यम में लार्वा जगह. उचित तापमान पर एक इनक्यूबेटर में पकवान स्टोर. ई) समय श्रृंखला 2-14 कदम दोहराएँ जब तक पर्याप्त समय अंक प्राप्त किया गया है. वैकल्पिक प्रोटोकॉल: यदि लार्वा के लिए एक बार से अधिक एक 30 मिनट के अंतराल भीतर imaged किया है यह अगले anesthetization समय बिंदु तक इमेजिंग चैम्बर में इसे छोड़ करने के लिए व्यावहारिक हो सकता है. 7-14 कदम दोहराएँ जब तक पर्याप्त समय अंक प्राप्त किया गया है. इस कदम पर सत्यापित करें: लार्वा नहीं हो रहा है एक समय में अधिक से अधिक दो घंटे के लिए इमेजिंग कक्ष में रखा, और न ही यह एक समय में 15-20 मिनट से अधिक समय के लिए anesthetized है. इमेजिंग चैम्बर के एक विधानसभा चित्रा. (ए) और तेल की परत पर प्लास्टिक स्पेसर लार्वा रखें. (बी) एक 22 x स्पेसर पर 22 मिमी कवर पर्ची प्लेस और कक्ष में Plexiglas गाइड अंगूठी डालने के लिए, अगले (सी) धातु की अंगूठी के साथ लार्वा की स्थिति को ठीक करने के लिए और (डी) चैम्बर बंद. (ई) अब चैम्बर माइक्रोस्कोप पर रखा जा करने के लिए तैयार है. चित्रा 2 ड्रोसोफिला लार्वा में शारीरिक दीवार की मांसपेशियों . स्नायु और NMJs एक संलयन CD8-GFP-दिनांक 8 प्रोटीन की अभिव्यक्ति के द्वारा visualized थे . मांसपेशियों के रूप में मनाया जब छल्ली के माध्यम से उदर पक्ष में लार्वा में ध्यान केंद्रित करने के लिए दिखाए जाते हैं. (एसी) सबसे सतही मांसपेशियों, 27, (KL) सबसे आंतरिक मांसपेशियों, 6 और 7 में दिखाया है, कर रहे हैं दिखाया. स्केलपट्टी: 100 सुक्ष्ममापी, स्लाइस के बीच ΔZ 2 सुक्ष्ममापी है. ड्रोसोफिला लार्वा शरीर में दीवार की मांसपेशियों की पहचान चित्रा 3. L3 ड्रोसोफिला लार्वा, खंड A3 में मांसपेशियों की पहचान, दिखाया गया है. स्नायु और NMJs एक संलयन CD8-GFP-दिनांक 8 प्रोटीन की अभिव्यक्ति के द्वारा visualized थे . मांसपेशियों के रूप में मनाया जब छल्ली के माध्यम से उदर पक्ष में लार्वा में ध्यान केंद्रित करने के लिए प्रदर्शित कर रहे हैं. एसी में सबसे सतही मांसपेशियों, 27, के.एल. सबसे आंतरिक मांसपेशियों, 6 और 7 में दिखाया गया है, कर रहे हैं दिखाया. स्केलपट्टी: स्लाइस के बीच 100 सुक्ष्ममापी, ΔZ 2 सुक्ष्ममापी है. ड्रोसोफिला लार्वा neuromuscular जंक्शनों के 4 पहचान चित्रा. NMJs (ई.) एक DGluRIIA mRFP संलयन एक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के द्वारा visualized थे . NMJs के रूप में मनाया जब छल्ली के माध्यम से उदर पक्ष में लार्वा में ध्यान केंद्रित करने के लिए दिखाए जाते हैं. (एबी) सबसे सतही NMJ, 27 में दिखाया गया है, सबसे इंटीरियर NMJs, 6 और 7, सीडी में दिखाए जाते हैं. स्केलपट्टी: स्लाइस के बीच 100 सुक्ष्ममापी, ΔZ 5 सुक्ष्ममापी है. (ई) और (एफ) (ई) सतही और अधिक इंटीरियर (एफ) NMJs की पहचान संदर्भ के लिए दिया जाता है.

Discussion

प्रस्तुत विधि शुरू ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा के शरीर दीवार मांसपेशियों पर glutamatergic synapses के अध्ययन के लिए विकसित किया गया था. ड्रोसोफिला neuromuscular जंक्शन (NMJ) एक टकसाली मांसपेशियों और न्यूरॉन्स के cyto वास्तुकला की विशेषता है और इस प्रकार आदर्श vivo इमेजिंग में के लिए उपयुक्त है . हालांकि, वर्णित anesthetization प्रोटोकॉल इमेजिंग NMJ तक ही सीमित नहीं है, ड्रोसोफिला लार्वा की पारदर्शिता वर्णित प्रोटोकॉल के अनुकूलन अंगों के विकास का अध्ययन करने के लिए, कोशिकाओं के प्रवास axonal और कोशिकाओं के भीतर उप सेलुलर पुनर्गठन कार्गो के परिवहन की सुविधा.

Materials

Reagents:

• Desflurane (Suprane, Baxter, Unterschleißheim, Germany)
• Halocarbon oil (e.g. Voltalef H10S oil / Atofina, Puteaux, France)
• Fly culture medium

Equipment:

• Inverted confocal microscope
• Binocular microscope (e.g. Stemi 2000, Carl Zeiss, Jena, Germany)
• Small paintbrush as used to sort flies
• Incubator
• Custom built imaging chamber (For mechanical drawings see Ref. 3)
• Vaporizer/anesthetization device (For details see Ref. 3)