Summary
本协议描述了一种可靠的方法，麻醉和完整的成像
Abstract
在光学成像，基因编码的荧光基团和遗传工具最近已经启用了改进，使所需的转基因动物线的建立有效的生物过程的研究，并在生活中甚至在某些情况下的行为，有机体。在这个协议中，我们将描述如何麻醉完整的果蝇幼虫，使用挥发性麻醉剂氟烷，跟随在亚细胞决议1-3突触人口的发展和可塑性。虽然其他有用的方法来麻醉果蝇幼虫以前曾描述4,5,6,7,8，本文介绍的协议表明由于以下组合键功能显着改善：（1）麻醉的程度非常高，甚至在被逮捕的心脏跳动允许横向分辨率可达150纳米1，（2）> 90％，每麻醉周期的成活率高，允许在一个小时内的五年多时间点的记录天2（ 3）高灵敏度，使我们在2个实例研究的动态表达的蛋白质在生理水平。在细节上，我们能够以可视化的突触后的谷氨酸受体亚基GluR - IIA表示，通过在稳定的转基因株系的内源性启动子1和外显子陷阱行FasII - GFP 1。 （4）与其他方法相比4,7幼虫可成像不仅活着，而且还完整无缺（即非解剖）观察到发生在若干天1。影随行的细节功能的各个部分在体内成像室2,3，幼虫，麻醉过程，如何重新确定在幼虫的具体岗位和幼虫安全拆除的正确安装，从成像会议厅。
Protocol
一）大会的成像室
- 选择的选择阶段的幼虫（如早期的第三龄幼虫离开约24小时的观测时间间隔在25 °，直到徘徊阶段彗星）。
- 幼虫用清水冲洗干净的培养基中，民建联干。
- 大衣中心室底部的元素，该地区面临的幼虫，用的卤烃油的薄膜。
- 忍受的腹侧方在会议厅内的显微镜物镜面临的幼虫（使神经肌肉接头（NMJ）26日和27日进行成像）（图1 AE）。
- 广场上一层油的塑料垫片，电网朝上（图1）通风槽。请确认在这一步：间隔的高度大约有一半的幼虫直径，缝隙宽度应幼虫直径的两倍左右。
- 放置在显微镜的成像室
二）幼虫麻醉
- 用适当的麻醉设备/蒸发器，连接香港总商会的两个进气口。
请验证的前端：
有效地氟醚在房间内的空气浓度不应超过安全法规规定的！只有一个很小的地氟醚的总量是需要麻醉的幼虫。地氟醚1（V / V）15％的应用程序已被证明是一个很好的出发点，确定要在实验中使用的理想浓度。出于安全原因，我们建议，蒸发器，不应该包含更多地氟醚，比需要2-4小时 ，在体内成像。 - 浸入一杯水室出口管的另一端，然后打开阀门控制流室约五秒钟的麻醉。
请确认在这一步：
气泡在水中升天？如果没有商会是漏水。 - 关闭阀门，约三秒钟。
- 在显微镜的监视残余幼虫运动。检查的心跳和肌肉的运动。如果有必要打开和关闭阀门，在步骤8和9所述，直到完成幼虫麻醉，然后关闭所有阀门，并开始成像。
请确认在这一步：
剩余的肌肉运动或心跳表明幼虫是不正确麻醉的。完整的麻醉是至关重要的高分辨率图像。幼虫一般应不长于15-20分钟，麻醉在一个给定的的时间。
三）成像
- 确定正确的地位和形象的利益格局（图2-4）。
四）从麻醉恢复
- 成像完成后，让空气进入墓室。
请确认在这一步：
检查发送的卤素灯幼虫的心跳和肌肉收缩。当肌肉开始收缩，它是安全的删除从成像室的幼虫。 - 从麻醉设备分离室，从显微镜中取出。仔细拆解的商会，并放置在泥飞栽培介质的幼虫。
- 存放在适当的温度在孵化器的菜。
五）时间序列
- 重复步骤2-14，直到已获得足够的时间点。
替代协议：
如果30分钟的时间间隔内超过一次成像幼虫，它可能是实际离开它，直到下一次麻醉时间点在成像室。重复步骤7-14，直到已获得足够的时间点。
请确认在这一步：
幼虫不保存时间超过两小时的影像室，也不是它是麻醉时间长于15-20分钟。
图1成像室大会 。 （a）将上一层油的幼虫和塑料垫片。 （b）将垫片上一个22 × 22毫米盖玻片和插入室有机玻璃导环，未来（三）修复的金属环的幼虫位置，和（D）关闭室。 （e）现在是随时可以安装在显微镜室。
图2在果蝇幼虫体壁肌肉 。肌肉和NMJs一个CD8 + GFP - SH表达融合蛋白8的可视化。作为观察对焦时成幼虫通过角质层腹侧的肌肉显示。在最浅肌层，27，（AC）显示，在（吉隆坡）最内部的肌肉，第6和7，显示的。比例尺：100微米，片之间的ΔZ是2微米。
图3在果蝇幼虫体壁肌肉的身份。表明身份，是A3，段L3 果蝇幼虫的肌肉。肌肉和NMJs一个CD8 + GFP - SH表达融合蛋白8的可视化。作为观察对焦时通过角质层腹侧到幼虫的肌肉显示。最浅肌层，27岁，在AC显示，在吉隆坡的最内部的肌肉，6日和7所示。比例尺：100微米，ΔZ之间切片是2微米。
图4 果蝇幼虫神经肌肉接头的身份。 （AD）NMJs的一个DGluRIIA MRFP融合蛋白 1表达的可视化。 NMJs是作为观察重点是通过角质层腹侧成幼虫。在（AB），最肤浅的NMJ，27岁，是所示，在CD最内部的NMJs，6日和7所示。比例尺：100微米，ΔZ之间切片为5μm。 （E）和（F）的肤浅的（E）和更大的内部（F）的NMJs的身份，以供参考。
Discussion
最初，该方法的开发研究谷氨酸对果蝇幼虫的体壁肌肉的突触。 果蝇神经肌肉接头（NMJ）的特点是一个定型的肌肉和神经细胞的细胞质架构，因而非常适合在体内成像。然而，描述的麻醉协议是不仅限于成像NMJ果蝇幼虫的透明度，有利于适应所描述的协议的研究器官发育，细胞迁移，细胞内的亚细胞的轴突货物和重组运输。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢安德烈亚斯Schönle，马克斯 - 普兰克学会国立精神卫生研究所，生物物理化学，德国和大卫J.桑德斯卓姆，美国马里兰州贝塞斯达，国家卫生研究院提供技术咨询。我们感谢弗兰克Kötting，欧洲神经科学研究所，哥廷根构造成像室和麻醉设备。由老年痴呆症Forschung主动TMRYZ赠款支持这项工作是由细胞和分子神经科学，蒂宾根大学的研究生院的奖学金，奖学金由中国国家留学基金管理委员会，SBH的支持。
Materials
Reagents:
Equipment:
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References
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