In vivo Imaging av intakt Drosophila Larver på sub-cellulära upplösning

Summary

Detta protokoll beskriver en tillförlitlig metod för anesthetization och avbildning av intakt<em> Drosophila melanogaster</em> Larver. Vi har utnyttjat inhalationsanestetikum desfluran för att möjliggöra upprepad bildhantering på sub-cellulära upplösning och förnyad identifiering av strukturer för upp till ett par dagar¹.

Abstract

De senaste förbättringarna i optisk avbildning, genetiskt kodade fluoroforer och genetiska verktyg som möjliggör effektiv etablering av önskad transgena djur linjer har gjort det möjligt biologiska processer som skall studeras i samband med en levande, och i vissa fall till och med uppför, organism. I detta protokoll kommer vi att beskriva hur man ska söva intakt Drosophila larver, med hjälp av inhalationsanestetikum desfluran, att följa utvecklingen och plasticitet av synaptiska populationer på sub-cellulära upplösning ^1-3. Medan andra användbara metoder att söva Drosophila melanogaster larverna har tidigare beskrivits ^4,5,6,7,8, visar protokollet som presenteras häri betydande förbättringar på grund av följande kombinerade viktiga egenskaper: (1) En mycket hög grad av anesthetization, även de hjärtslag arresteras möjliggör lateral upplösning på upp till 150 nm ^1, (2) en hög överlevnad på> 90% per anesthetization cykel, som tillåter inspelning av mer än fem gång-poäng under en period av timmar till dagar ² och ( 3) en hög känslighet gör det möjligt för oss i två fall för att studera dynamiken i proteiner uttrycks vid fysiologiska nivåer. I detalj, kunde vi visualisera postsynaptiska subenheten glutamat receptorn GluR-IIA uttryck via kroppens promotor ¹ i stabila transgena linjerna och exon trap line FasII-GFP ^1. (4) I motsats till andra metoder ^4,7 larverna kan avbildas inte bara vid liv, men också intakt (dvs icke-dissekeras) gör observationen att ske under ett antal dagar ^1. Den medföljande videon detaljer funktionen hos enskilda delar av in vivo imaging kammare ^2,3, korrekt montering av larver, det anesthetization förfarande, hur man åter identifiera specifika positioner inom en larv och säker borttagning av larver från den avbildning kammare.

Protocol

A) Montering av imaging kammaren Välj en larv utvalda skede (t ex tidig 3: e INSTAR larver lämnar en observation intervall på cirka 24 timmar vid 25 ° C tills vandrande scenen). Skölj larven med vatten för att rengöra den i odlingsmedium och sandskädda den torr. Täck mitten på nedre delen av kammaren, regionen att möta larven, med en tunn film av Halocarbon olja. Sätt larven med den ventrala sidan mot mikroskopet mål i kammaren (låter neuromuskulära förbindelsen (NMJ) 26 och 27 som ska avbildas) (Figur 1 AE). Placera plastmellanlägget på oljan lager med luft spår av uppåt nätet ansiktet (Figur 1 A). Bekräfta i detta steg: Höjden på spacer är ungefär hälften av larver diameter, bör bredden på slitsen vara ungefär dubbelt så stor diameter larven. Placera avbildning kammare på mikroskopet B) Anesthetization av larven Anslut de två vikar av kammaren med en lämplig anesthetization enhet / förångaren. Bekräfta up-front: Den effektiva koncentrationen av desfluran i rummet luften ska aldrig överstiga den som anges av säkerhetsföreskrifter! Endast en mycket liten total volym på desfluran behövs för att söva larver. Tillämpningen av 15% (v / v) desfluran 1 har visat sig vara en bra utgångspunkt för att bestämma den idealiska koncentration som används i ett experiment. Av säkerhetsskäl föreslår vi att förångaren bör aldrig innehålla mer desfluran än vad som behövs i 2-4 timmar in vivo imaging. Sänk den andra änden av röret bifogas kammaren utlopp i ett glas vatten sedan öppna ventiler som styr flödet av bedövningsmedel in i kammaren i ungefär fem sekunder. Bekräfta i detta steg: Har luftbubblor stiga upp i vattnet? Om inte kammaren läckande. Stäng ventilerna i ungefär tre sekunder. Övervaka kvarvarande larver rörelser i mikroskop. Kontrollera både hjärtslag och rörelser muskler. Om det behövs öppna och stänga ventiler som beskrivs i steg 8 och 9 tills anesthetization av larven är färdig, stäng alla ventiler och börja avbildning. Bekräfta i detta steg: Kvarvarande muskelrörelser eller hjärtslag indikerar att larven inte är ordentligt sövd. Komplett anesthetization är avgörande för högupplösta bilder. Larven ska normalt inte bedövas under längre tid än 15-20 minuter vid en viss tidpunkt. C) Imaging Identifiera rätt läge och bild strukturen av intresse (Figur 2-4). D) Återhämtning från anesthetization Efter bildbehandling är klar släppa in luft i kammaren. Bekräfta i detta steg: Kolla hjärtslag och muskelsammandragningar av larven som överförs halogenlampa. Eftersom musklerna börjar upphandlande det är säkert att ta bort larven från avbildning kammaren. Lossa kammaren från anesthetization enheten och ta bort den från mikroskopet. Demontera kammaren försiktigt och placera larven i mosade flyga odling medium. Förvara skålen i en inkubator vid lämplig temperatur. E) Tidsserie Upprepa steg 2-14 tills tillräcklig tid poäng har erhållits. Alternativa protokoll: Om larven ska avbildas mer än en gång inom en 30 minuters intervall kan det vara praktiskt att lämna den i bildbehandling kammaren tills nästa anesthetization tidpunkt. Upprepa steg 7-14 tills tillräcklig tid poäng har erhållits. Bekräfta i detta steg: Larven är inte förvaras i bildbehandling kammare för mer än två timmar åt gången, inte heller är det att vara sövd under längre tid än 15-20 minuter åt gången. Figur 1 Montering av avbildning kammaren. (A) Placera larv och plastmellanlägget på oljan lagret. (B) Placera ett 22 x 22 halka mm locket på spacer och sätt i plexiglas styrring in i kammaren, nästa (C) fastställa positionen för larven med metallring och (D) Stäng kammaren. (E) Nu kammaren är redo att monteras på mikroskopet. Figur 2 Body-vägg muskler i Drosophila larver. Muskler och NMJs var visualiseras genom uttryck för en CD8-GFP-SH fusionsprotein 8. Musklerna visas som observerats när fokusera på ventrala sidan genom nagelbanden i larven. I (AC) den mest ytliga muskel, 27, visas i (KL) den mest inredning musklerna, 6 och 7, visas. Skala Bar: 100 ìm är ΔZ mellan skivor 2 ìm. Figur 3 identitet kroppen vägg muskler i Drosophila larver. Identiteten för musklerna i L3 Drosophila larver, segment A3, visas. Muskler och NMJs var visualiseras genom uttryck för en CD8-GFP-SH fusionsprotein 8. Musklerna visas som observerats när fokusera på ventrala sidan genom nagelbanden i larverna. I AC mest ytliga muskel, 27, visas i KL de mest inredning musklerna, 6 och 7, visas. Skala Bar: 100 ìm, ΔZ mellan skivor är 2 ìm. Figur 4 Identifiering av neuromuskulära korsningar av Drosophila larver. (AD) NMJs var visualiseras genom uttryck för en DGluRIIA-mRFP fusionsprotein 1. Den NMJs visas som observerats när fokusera på ventrala sidan genom nagelbanden i larven. I (AB) den mest ytliga NMJ, 27, visas i CD mest inredning NMJs, 6 och 7, visas. Skala Bar: 100 ìm, ΔZ mellan skivor är 5 ìm. (E) och (F) identitet ytliga (E) och mer interiör (F) NMJs ges som referens.

Discussion

Den presenterade metoden utvecklades ursprungligen för att studera glutamaterg synapser på muskler kroppen väggen i Drosophila melanogaster larver. Den Drosophila neuromuskulära förbindelsen (NMJ) kännetecknas av en stereotypisk CYTO-arkitekturen i muskler och nervceller och är därför idealisk för in vivo imaging. Dock är de beskrivna anesthetization protokollet inte begränsat till avbildning av NMJ, insyn i Drosophila larver underlättar anpassning av de beskrivna protokollet att studera utvecklingen av organ, migration av celler, transport av axonal last och sub-cellulära omorganisation i celler.

Materials

Reagents:

• Desflurane (Suprane, Baxter, Unterschleißheim, Germany)
• Halocarbon oil (e.g. Voltalef H10S oil / Atofina, Puteaux, France)
• Fly culture medium

Equipment:

• Inverted confocal microscope
• Binocular microscope (e.g. Stemi 2000, Carl Zeiss, Jena, Germany)
• Small paintbrush as used to sort flies
• Incubator
• Custom built imaging chamber (For mechanical drawings see Ref. 3)
• Vaporizer/anesthetization device (For details see Ref. 3)