Métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico no sistema nervoso central de mamíferos
Summary
Transecção do nervo óptico é um modelo amplamente utilizado de lesão do SNC adulto. Este modelo é ideal para a realização de uma série de manipulações experimentais que visam a retina globalmente ou diretamente a população-alvo feridos neuronal de células ganglionares da retina.
Abstract
Células ganglionares da retina (RGCs) são neurônios do SNC que a informação de saída visual da retina para o cérebro, através do nervo óptico. O nervo óptico pode ser acessado dentro da órbita do olho e completamente seccionado (axotomized), cortando os axônios de toda a população RGC. Transecção do nervo óptico é um modelo reprodutível de morte celular por apoptose neuronal no SNC adulto 1-4. Este modelo é particularmente atraente porque a câmara vítrea do olho funciona como uma cápsula para entrega de drogas para a retina, permitindo manipulações experimentais através de injeções intra-ocular. A difusão de substâncias químicas através do fluido vítreo garante que eles agem sobre toda a população RGC. Vetores virais, plasmídeos ou curto RNAs de interferência (siRNAs) também pode ser entregue à câmara vítrea, a fim de infectar ou transfecção as células da retina 12/05. O tropismo elevado de vírus adeno-associado (AAV) vetores é benéfico para RGCs alvo, com uma taxa de infecção de aproximadamente 90% de células perto do local da injeção 6, 7, 13-15. Além disso, RGCs pode ser seletivamente transfectadas aplicando siRNAs, plasmídeos ou vetores virais para o fim do corte do nervo óptico 16-19 ou vetores injetar seu alvo o colículo superior 10. Isso permite que os pesquisadores a estudar mecanismos apoptóticos na população neuronal feridos sem efeitos de confusão sobre os neurônios ou células gliais bystander outras circunvizinhas. RGC apoptose tem uma característica de tempo-curso em que a morte da célula é retardado postaxotomy 3-4 dias, após o qual as células degeneram rapidamente. Isso proporciona uma janela para manipulações experimentais contra processos envolvidos na apoptose. Manipulações que visam directamente o RGCs do tronco do nervo óptico transeccionados são realizadas no momento da axotomia, imediatamente após o corte do nervo. Em contraste, quando as substâncias são entregues via uma rota intra-ocular, que pode ser injetado antes da cirurgia ou durante os primeiros três dias após a cirurgia, que precede o início da apoptose em RGCs axotomized. No presente artigo, demonstramos vários métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico.
Protocol
Discussion
Transecção do nervo óptico é um modelo altamente reprodutível de apoptose adulto CNS neurônio. As manipulações experimentais demonstraram neste manuscrito permitir o estudo dos mecanismos da apoptose RGC após a lesão.
Injeções intra-oculares são úteis para o direcionamento global da retina. Este procedimento requer alguma prática, pois é fundamental para não ferir a lente com a ponta da pipeta de vidro. Danos lente foi mostrado para causar a liberação de fatores de crescim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PDK é suportado por uma operação CIHR subvenção (MOP 86,523)
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Stereotaxic Frame | Stoelting, Kopf, WPI | |||
| Rat Gas Mask | Stoelting, Kopf, WPI | |||
| Anesthesia System | VetEquip | 901806 | ||
| Isoflurane (PrAErrane) | Baxter Corp | DIN 02225875 | ||
| Surgical Microscope | WPI, Zeiss, Leica | |||
| Alcaine Eye Drops | Alcon | |||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | |||
| Fine tip Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | ||
| 10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2) | Hamilton Syringe Co. | 80030 | ||
| 1/16 inch Compression Fittings | Hamilton Syringe Co. | 55751-01 | ||
| 1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing | Supelco, Bellefonte, PA | Z226661 | ||
| Dual RN Glass Coupler | Hamilton Syringe Co. | 55752-01 | ||
| Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa | Hamilton Syringe Co. | PRMKIT |
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