Summary
이 동영상은 호기성 곰팡이로 리그노셀룰로오스성 식물 조직의 저하를 연구하기위한 통제된 환경의 접근 방식을 보여줍니다. 영양 소스 및 습기를 제어하는 능력은 한천 블록 microcosms의 주요 장점이지만, 그 접근 방식은 종종 혼합 성공을 산출. 우리는 재현성, 낮은 다양성의 결과를 얻을 수에 중요한 함정을 해결합니다.
Abstract
리그노셀룰로오스성 식물 조직의 곰팡이 biodegradation를 공부에 대한 두 가지 주요 방법은 목재 방부제 테스트 (; 한천 블록 토양 블록)에 대한 개발되었습니다. 이것은 토양 블록 microcosms 높은 붕괴 속도, 적은 수분 문제, 연구 중 낮은 다양성, 그리고 방부제의 독성 높은 임계값을 얻을 것을 잘 허용됩니다. 토양 블록 테스트 따라서 더 활용 기법이며, 테스트 및 재료에 대한 미국 사회 (ASTM) (방법 D 1413-07)에 의해 표준화되었습니다. 토양 블록 디자인은 로컬 변수 토양 소스를 사용하지만, 단점을 가지고 있으며, 썩어 조직에 영양분을 외부 (외인성)의 통제를 제한 인치 이러한 단점은 다른, 점점 인기를 연구 목적으로이 방법을 적용의 문제로 등장했습니다. 이러한 현대의 목적은 네트워크 hyphal 함께 산화 메카니즘 및 추적 translocated 요소를 평가 공동 대사 toxics의 bioremediation 테스트 bioenergy 연구를위한 굴욕 lignocellulosics를 포함. 토양 - 블록은 이러한 응용 프로그램에 충분한 제어를 빌려하지 않습니다. 정제 한천 블록 접근 방식이 필요합니다.
여기, 우리는 나무 저하 곰팡이 Serpula lacrymans은 낮은 칼슘 한천과 함께 깊은 배양 접시를 이용하여 한천 블록 microcosms의 나무이 저하될 수있는 갈색 썩음을 사용합니다. 우리는 유틸리티 및 예상 다양성을 설명하는 시간 시리즈 부패에 대한 외인성 석고의 역할을 테스트합니다. 싱글 보드 격랑 (세로 컷)에서 블록은 냉방 무게, autoclaved, 플라스틱 메쉬 위에 무균 소개하고 있습니다. 외인성 석고는 인터페이스에서 추가로 곰팡이 예방 접종, 각 블록 얼굴을하고 있습니다. 수확은 최종 파괴 추수 때까지 무균 수 있습니다. 이러한 microcosms은 한천이나 배양 접시의 벽 블록 접촉을 피하기 위해 설계되었습니다. 결로는 접시 쏟아 도중 부화하는 동안 최소화합니다. 마지막으로, inoculum / 석고 / 목재 간격은 있지만 접촉을 허용하지 않고 최소화됩니다. 한천 블록 디자인이 덜 기술적인 관점은 또한 오류 및 연구 사이에 변화의 핵심 소스의 가장 흔한 원인입니다. 비디오 간행물이 경우에 따라서 유용합니다, 우리는 낮은 다양성, 높은 품질의 결과를 보여줍니다.
Protocol
이 프로토콜은 물론 오븐이나 공기 건조 소재로로 설명, 우디 및 비 - 우디 기판에 적용됩니다. - 설정하기 전에, 그러나, 먼저 프로토콜을 통해 읽어보십시오. 여러 학업에 적용할 수 제기된 점, 이러한 포인트 (밑줄) 계획 필요가 있습니다. 또한, 우드 보호에 관한 국제 연구 그룹 (IRG - WP) 용기 (1978)에 의해 제출된 논문 따라 간혹 사용되는 두 출판 한천 블록 방식, 영국 표준 838 하나가 또있다는 것을 유의하십시오. 우리는 주로 소우주 디자인과 한천 배지의 컨트롤에 수정, 방법 838과 유사하지만, 다시 두 가지 접근법은 종종 산소 결핍과 변화를 일으키는, 나무 블록 역사 수분 관리 문제로 인해 피할 수 있습니다. 838 표준을 포함하여 한천 블록 디자인의 논의를 포함하고 이러한 검사 방법의 좋은 검토는, 니콜라스 (1973)에서 찾을 수 있습니다.
1) Microcosms 준비
이 실험에 대한 Microcosms 나무 블록 위에 머리 공간을 증가, 전형적인 배양 접시보다 1cm 키가 (깊이)입니다. 그들은 그들의 농도 이외에, 절대적인 영양소 금액을 제어하고, 잘 거리 (> 3mm) 뚜껑의 나무 블록을 유지하기 위해 한천의 겸손한과 정확한 금액으로 가득합니다. 석고 테스트의 경우에 사용되는 한천은 낮은 칼슘 타입 한천되지만, 우리는 블레이 크 슬리의 매체 테스트 (Wulfen : 프라이스) Serpula lacrymans의 분리 유지를위한 ATCC 권장 매체를 사용하는 대표적인 결과를 보여 Schroeter 변형 EMPA 65 ( ATCC 32750).
이 디자인은 한천 연락처 및 거리 접시 뚜껑과 벽에서 멀리 식물 조직을 유지합니다. 리그노셀룰로오스성 기판 가변 젖음는 한천 블록 시험에 변화의 주요 원천입니다. 수분 함량을 증가 젖음하면 산소 결핍을 만들고 억제하거나 중단 에어로빅의 biodegradation. 그것은 또한 누군가가 나무 분해에 대한 책임 갈색과 흰색 부패의 곰팡이의 산화 메커니즘을 연구에 대한 문제를 만듭니다. 플레이트 뚜껑에 응축 무료 물방울 양식하는 경우 문제이며, 기판 젖었어. 80 % 초과하는 수분 내용에 선도 (건조 WT. 기준)과 에어로빅 저하를 중단되면 연락을, 마찬가지로, 목재 및 기타 조직은 한천에서 빠르게 수분을 '심지'것입니다. 조직은 사상균이 기판 내에서 검색, 연결, 제어 습기 수 있도록,이 물 소스로부터 멀어져해야합니다.
- 20 ML 한천, 각 배양 접시의 원하는 숫자를 채우기 위해 충분한 한천 미디어합니다. 우리 주민들은 과거의 결과를 사용하여 전력 분석에 의해 결정, 치료, 당 (n은 = 5) 복제 사용합니다.
- 칼슘과 철분이없는 타입 한천을 위해, 우리는 1.0 g NH 4 NO 3, 1.0 g 일염기의 KH 2 PO 4 0.25 g MgSO 4 X와 개정 약 400 ML 탈이온수을 포함한 500 ML의 판매량 플라스크에 15g의 한천을 추가 7H 2 O, 및 1.0 g의 포도당. 혼합하기 위해, 우리는 micronutrients를 추가하는 재고 솔루션을 사용합니다. 우리는 50 μl H 3 BO 각각 4 (0.057 g / 100 ML)과 ZnSO 4 (0.031 g / 100 ML)를 추가합니다. 우리는 50 μl MnCl 2 (0.036 g / 100 ML), CuSO 4 (0.039 g / 100 ML)를 각각 추가하고, (NH 4) 6 모 7 O 24 (0.018 g / 100 ML). 일단 영양소는 500 ML 라인 체적 휴대용 술병을 작성, 추가됩니다.
- 이 경우에 전형적인 칼슘 또한 0.05 g CaCl 2 X 2 시간 2 O / 500 ML 것입니다. 우리의 경우에는, 우리는 5 밀리미터 최종 농도와 치료로 한천 칼슘을 사용합니다. 우리는 다른 microcosms에 NaCl 5 밀리미터를 추가하여 이온 강도 및 염화물과 더불어 증가 카운터. 마찬가지로, 우리는이 예제에 대한 철없는 미디어를 사용하지만 철분이 포함되어있는 경우에, 우리는 2 ML 탈이온수와 FeSO 4 0.112 g을 혼합하고 즉시 vortexing 후 신선한 솔루션을 50 μl합니다 (주식)을 추가합니다. 당신은 영양분의 추가를 제어하는 미디어, 그것은 autoclaving 전에 산도를 테스트하는 것이 현명합니다. 산성 또는 기본 추가 (예 : FeCl 3) 응고에 영향을줍니다.
- 플라스크에 미디어를 전송하고 121 ° C 20 분 16 PSI에서 매체를 압력솥. 우리는 시험 접시에 모두를 관리할 수 있습니다 전에 한천이 응고하는 것을 피하기 위해, 500 ML 볼륨 (1000 ML 플라스크 당)를 초과할 수 없습니다.
(참고 :.. 먼저 테스트 균류는 그것에 성장할 것으로 확인 대안 미디어, 추가 기저 염분 특히 최소한의 영양 한천을 사용하는 경우 그것은 현명 높은 이온 강도가 성장을 억제하거나 격리 검사를 죽일 수 있습니다) - biosafety 캐비닛에 무균 배지를 전송하는 휴대용 피펫 에이드 10 ML 살균 폴리스티렌 pipettes를 사용하여 한 번 멋진 flasks. 터치 미디어 냉각시키는 것은 응축을 최소화하기 위해 여기에 중요합니다. 또한, 그들은 뚜껑에 무료로 물을 최소화하기 위해, 부어 있으므로 높은 접시를 쌓아. 결로 정상 culturing에 성가신 있지만, 여기서는 큰 문제를 나타냅니다 경우 droplets 양식 나무 젖었어. 80 % (건조 중량 기준) 이상의 수분 컨텐츠 (MC)는 호기성 곰팡이에 의해 조직의 한계 붕괴를 산소 결핍을 만들고, 다양성을 증가합니다. 다음과 같이 MC를 계산 :
MC * = [(신선한 체중 X 건조 중량) / 건조 중량] X 100
* (-이 MC를 계산하는 이상한 방법으로 보일지도 모르지만, 표준 MC 100 %를 초과할 수 있음)- 대체 microcosms : 식물의 조직을 검사하는 경우에는 어떤은 사전 가공된과 (예, 옥수수 스토버 줄기와 잎, 함께) sieved해야합니다, 우리가 사용하는 두 접시 옵션이 있습니다. 나누어 배양 접시 2 또는 4 섹션에서 사용할 수 있으며, 한천은 가루로 구획에서 제외시킬 수 있습니다. 확정 한천도 절단 부분 파우더 공간을 떠날 제거하지만, 치료는 영양 가용성 제어하는 경우에는 나머지 동일 한천 볼륨을 유지하기 위해 이동해야합니다 수 있습니다.
- 넉넉한 깨끗이 세탁하고 autoclaved 격자는 무균 추가 사용 플레이트 표면에 플라스틱 메쉬 그리드를 잘라 추가합니다. 우리는 우리의 메쉬를위한 제품, 거터 경비를 (35 X 50mm, 두께 2mm), 사용 및 비누와 물로 세척 후에 깨끗한 표면을 표시하고 곰팡이 침투의 부족을 보여주 전자 현미경을 스캔 사용하고 있습니다. 우리는 유리 섬유 필터와 위킹 문제로 인해 직접 개발한 mycelia에 누워 블록 모두 혼합 성공을 있었다. 당신은 붕괴를 얻을 것이다, 그러나 다양성의 계수 (CV)는 치료 비교 통계 약한하고, 높은 것입니다. 우리는 이전에 유리 막대를 사용하지만, 블록은 한천과 연락 블록을 떠나, jostled 때 막대를 슬라이딩으로 감염될 수 있습니다. 하나의 좋은 대안은 inoculum를 수용 하나의 모서리를 잘라, 접시에 맞는 완벽한 동그라미를 잘라하는 것입니다. 일반적으로 자신을 설정에 맞게 그리드 잘라하지만, 그들이 배양 접시에 완전히 평평하게 누워 있는지 확인하십시오.
2) '차단'기판 준비
이러한 프로토콜은 단단한 위해 개발하지만, 다른 식물의 조직에 대한 적응력 아르되었습니다. 질량 손실 filamentous 곰팡이에 의해 저하 나무 부식 진행을위한 표준 측정하기위한 한 방법입니다. 따라서, 우리의 접근 방식은 이후의 붕괴 대량 손실을 결정 및 예약 오븐 건조 중량을 사용합니다. 단, bioenergy 연구를 위해, 초점은 식물 조직 화학에 어디에, 많은 조직을 건조 공기가 좋습니다 것을 발견했습니다. 우리는 오븐 건조 시작 자료를 사용하기 위해 한천 블록의 문화를 준비 여기 프로토콜을 보여주지만, 가루 대신 고체 기판을 처리하는 것도 건조하고 공기에 다른 정보를 제공합니다.
- 이 예제의 경우, 우리는 남부 옐로 파인 (SYP)를 사용합니다. SYP은 그 네 가지 피너스 종 중 하나가 될 수있는 미국에서 주거 주택에 사용되는 목재의 대다수를 대표하는 상업에 사용할 목재입니다. 곡식 (19 X 19mm)를 따라 비 치료 목재가 사용되며, 매듭없는 블록은 하나의 격랑 (세로 컷)에서 절단됩니다. 이것은 나무에 화학 변화를 최소화합니다. 이 길이는 19mm 3 블록으로 절단됩니다. 우리는 토양 블록 재판이 크기를 사용하여 테이블에 단일 세션에서 여러 블록을 보았다 잘라.
- 한천 - 블록 microcosms에 사용되는 19mm 3 블록은 더욱 끌과 망치가 아닌 본을 사용하여 곡식을 따라 반으로 쪼개 수 있습니다. 이것은 하나의 거친 블록 가장자리 플라스틱 메쉬, 그리고 라벨 부드러운 상단 모서리에 엎드려서 얼굴을 수 있습니다. 라벨 블록 연필로. 당신이 기판에 레이블을 수 없다면, 샘플과 함께 유지하는 시스템을 고안해야합니다. (다시, 우리가 치료 당 N = 5를 사용)하여 치료를 충족시키기뿐만 아니라 오염 모니터로와 병렬로 시설 기본 데이터 샘플로 모두 될 것입니다 비 주사 컨트롤 충분히 블록을 잘라.
- 100 대류 오븐에서 오븐 건조 재료, 장소 샘플 ° C 48 시간을위한. 공기 건조 재료가 필요한 경우, 조건 일정한 습도와 온도 챔버 또는 방에있는 샘플. 우리는 65 % RH 20 ° C를 사용하여, 우리는 일반적으로 재료에 따라, 10-14 일 시설에 포함됩니다.
- 사전 무게 초기 오븐 건조하거나 신선한 무게를 결정하기 위해 귀하의 샘플을. 오븐에서 샘플과 함께 간단하게 그들을 냉각하고 무게에 건조기에 샘플을 전송할 수 있습니다.
- 공기 건조 대안 : 공기 건조 소재, 다섯 샘플을 (N = 5; 희생이이 microcosms에서 사용되지 않습니다), 그들 위에서 오븐 건조, 그들이 신선한 무게, 그리고 건조 후 다시 무게. 다음과 같은 두 블록 각각에 대한 수분 보정 계수를 계산 :
MC 보정 계수는 = 건조 중량 / 신선한 무게
예 : 2.46 g (건조) / 2.68 g (신선한) = 0.918, 그래서, 3.0 g 신선한 블록은 2.75 g 오븐 건조
평균 다섯 샘플의 평균 보정 계수를 얻을 수 있습니다. 그런 다음 공기 건조 블록의 모든 무게. 초기 오븐 건조 중량을 결정하기 위해 평균 MC 보정 계수하여 각 중량을 곱하면됩니다.
- 공기 건조 대안 : 공기 건조 소재, 다섯 샘플을 (N = 5; 희생이이 microcosms에서 사용되지 않습니다), 그들 위에서 오븐 건조, 그들이 신선한 무게, 그리고 건조 후 다시 무게. 다음과 같은 두 블록 각각에 대한 수분 보정 계수를 계산 :
- 압력솥은 121에서 샘플을 표시 ° C와 큰 샘플 1 시간, 이상 16 PSI. 단단히 젖음을 최소화하기 위해 호일.
- Alternati했습니다 살균 : 가능하다면 감마 방사선이, 소독하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 함께 노 강도 손실 또는 색상 변경과 hemicellulose 손실에 대한 온도의 영향 이전에 가문비나무와 너도밤나무 나무를 테스트하고, 아무것도 발견이 없습니다. 그러나 이것은 기판과 환경 설정 / 요구 사이에 다를 수 있으며, 감마 방사선이 입증된 대안입니다.
- 이 예제의 경우, 우리는 우리의 소나무 (SYP) 샘플 저하에 단단한 석고의 역할을 (1 % FeSO 4 대 순수) 테스트입니다. 이들은 다시 그들의 농도 이외에 자신의 가용성을 제어하는, 정확한 표면 영역과 볼륨이있는 디스크로 만들어집니다. 이들은 별도로 autoclaved 및 접종의 단계에서 추가됩니다. 우리는 모든 블록에 대해 하나 디스크를해야하고, 두 가지 수확을 허용하도록 배양 접시 당 두 블록을 추가합니다.
3) Inoculating 및 라벨링
한천 - 블록 microcosms을 Inoculating하면 토양 블록의 단지를 inoculating 이상의 시간이 소요됩니다. 우리가, 우리는 3 분 복용 각 접종에 포함됩니다. 한천이 포함된 배양 접시하려면, 메쉬, 나무, 모든 외인성 영양 소스 (여기서, 석고 알약)을 위해 또한 지점 및 균류이다. 때문에 뚜껑이 열려있는 시간의 양과 내부 방문수의 오염에 대한 기회를가 증가합니다. 일반적으로이 단계에서 만든, 이들이 최상의 텍스트로 비디오를 결합하여 적용하는 여러 가지 중요한 실수도 있습니다. 동영상을보세요.
- 멸균 biosafety 캐비닛에서, 빈 한천 요리하여 곰팡이 inoculum (우리 2 주 문화를 사용), 메쉬, 식물 기판 (나무), 외인성 물질, 샤피, parafilm 스트립 및 전송 도구 소스 접시를 조립. 우리는 화염 70 % 에탄올을 사용하여 소독하고, 우리는 블록과 메쉬를위한 inoculum와 포셉위한 전송 도구를 사용하십시오. Parafilm은 가장자리에있는 모든 닉스을 피하기 위해 레이저로 절단한다. 밀봉하면 parafilm에 닉스 휴식을 초래할, 그리고 이것은 샘플을 밀다 및 재입국 필요합니다.
- 화염 전달 도구 또는 다음 (이 순서로) 추가하기 전에 포셉 :
- 플라스틱 메쉬.
- 나무 기판. 우리 시연을 위해, 우리는 모두 우리가 일찍 늦게 수확에서 데이터를 쌍을 수 있도록 분할되던 초기 블록에서 메쉬의 길이 두명 나무 블록을 추가합니다. 이러한 블록은 곰팡이 inoculum의 소스의 지점을 마주 곡물 엔드 (나무 단면)과 함께 나란히 추가됩니다.
- 외인성 물질. 여기, 우리는 사상균에 의해 부패에 석고의 역할을 테스트하고 있습니다. 따라서, 우리는 나무에 도달하기 전에 이러한 석고 디스크를 만날 수있는 균류를 원한다, 그리고 따라서 메쉬 위에 각 inoculum 포인트와 블록 사이에 한 석고 디스크를 추가합니다. 이것은 소우주 당 2 디스크를 추가하는 것을 의미합니다. 디스크와 나무 사이의 접촉을 허용하지만, 그들이 가까이 두지 마십시오.
- 곰팡이 inoculum. 우리는 20 ML 한천 재배 2 주 문화의 플러그를 만들기 위해 7mm 직경 # 4 코크 송곳을 사용합니다. 이것은 inoculum 볼륨을 조절하는 데 도움이됩니다. 비 주사 컨트롤, 그것은 살균 접시에서 플러그인을 추가하는 것이 좋습니다. 우리는 일반적으로 한천 이러한 플러그를 추가하고, 아닌 메쉬에. inoculum 및 외인성 기판이나 나무 중 사이의 접촉을 허용하지만, 다시, 그들이 함께 가까이 두지 마십시오. 블록 당 하나의 inoculum 플러그가 있습니다.
참고 : 나무 블록과 뚜껑 벽 사이에 최소 3mm 거리가있을 것이라고, 머리 공간이 적어도 3mm있을 것입니다 수 있도록 시작하기 전에 한천 요리에서 이러한 내용을 조립하는 것이 현명하고, 당신의 플라스틱 메쉬 크기는 쉽게 기판을 수용합니다.
- Parafilm 요리는 알코올 화염 연소를 유지, 그들을 봉인하고 포셉 준비와 함께합니다. 부드러운 연속 동작으로 수평 접시와 포장 parafilm 잡아. 경우 parafilm 바꿈 또는 경우 내용 밀다, 제거 parafilm, 다시 입력하고 내용을 조립하고 다시 시도해보십시오.
- 각 기판의 상단을 통해 직접 블록 번호를 라벨 알코올 방지 마커를 사용하여 요리의 뚜껑을 라벨. 우리는 또한 석고 디스크 위에 동그라미를 그립니다. 나무 자연 붕괴로, 당신은 가능성이 기판에 라벨을 읽을 수있는 능력을 잃게됩니다. 접시 위치로 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 저하 또는 금속 등 다른 재료 종류의 무수한 식민지로 균류에 대한 능력을 과소 평가하지 않아.
- 귀하의 메쉬에 민감한 조립을 가지고있는 경우, 보육주의 깊게 번호판을 전송합니다. 우리는 한 번만, 문 잼에 대한 접시의 빈을 찧으하고 다시 조립 접시에 있었다. 시간을 가지고, 그리고 경로를 플롯. 그것은 한 번만 관심사이기 때문에 신경이 한번 가져가라.
4) 잠복기 및 착취
플레이트는 온도 변화에 의한 결로를 방지하기 위해, 당신의 균류에 맞게 incubated 수 있지만, 생물 학적 보육 가능한 경우에 보관해야합니다. 시간 시리즈 수확은 마지막으로 수확을 제외하고, 무균 할 수 있습니다. 이러한 중간 수확이의 성장 이후에 완료되면기판은 번호판을 처리하면 균사 상호 링크 기판 때문에 쉽습니다, 중요하다.
- 우리 시연을 위해, 우리는 20 ° C에서, 어둠 속에서 접시를 품어. 주 5 수확 시점에서, 우리는 전체 치료을 많이 제거 70 % 에탄올로 각각 아래와 위로를 스프레이하고 biosafety 캐비닛 내부 물질을 제거하는 골조 집게를 사용합니다.
- 어떤 형태 또는 melanization에 초점을 맞추고, 한천 플레이트를 파괴하기 전에 사진을 가져가라.
- 사용자의 요구가 필요로 취급하는 블록을 제거합니다. 멀리 초과 균사를 (nitrile 장갑 포함) 롤, 그러나 어떤 부식하는 물질을 잃지 않게 조심해야하는 손가락을 사용합니다. 우리는 알루미늄 보통 오븐 건조 블록 과도 위킹에 대해 모니터링하는 컨트롤의 신선하고 건조 무게를 사용하여 대량 손실을 결정하기 위해 팬 나가는거야. 이것은이 방법 다음과 같은 최소한해야하지만 우리는 또한, 레이블을 명확하게 수상 기록되는 갈색 어두운 블록을 추적합니다. 질량 손실 데이터 게이지 붕괴 진행 도움, 그리고 원소 농도 나중에, g - 중량 기준으로 계산해야하는 경우 중요 데이터입니다. 또한 비율 데이터가 통계 정상화이어야합니다. 다음과 같이 우리는 계산 :
%의 질량 손실 = [(초기 체중 최종 체중) / 초기 무게] X 100- 대체 공기 건조 : 당신이 생물학적으로 더 자료를 치료 목표와 공기 건조가 필요한 경우, 당신이 수리하다 섹션 2.3에서 조절 정권을 사용해야합니다. 당신은 대량 손실을 결정해야하는 경우, 그것이 수분 함량의 측정이 필요합니다, 하나의 솔루션은 크고 작은 부분에 블록 (또는 분말)을 분할하는 것입니다. 모두 무게, 단지 작은 부분을 오븐 건조. 총 신선한 무게에 적용 후 위에서, 수분 함량 변환 계수를 계산하고, 소형 + 대형 부분 (총 블록 신선한 무게). 이전 당화 또는 기타 프로세스, 대량 손실에 곰팡이와 자료를 pretreating하면 곰팡이에 의해 소비 탄수화물 나중에하고 계정에 대량 균형을 결정 당신을 도움이 될 것입니다 특히.
- autoclavable 가방의 문화를 파괴하지만, 플라스틱 지원 메쉬와 미래의 실험에 사용하기 위해 재활 용할 수있는 다른 구성 요소를 저장합니다.
5) 결과 해석
리그노셀룰로오스성 조직은 일반적으로 한천 블록 디자인에서 느리게 붕괴되지만,이 시점에서 당신은 심지어 중간 붕괴 수준에서 상대적으로 낮은 다양성이 있어야합니다. 당신은 또한 통제 조직의 중간 (20~50%), 높은 습기가없는 있어야합니다.
- 곰팡이에 노출되지 목재의 수분 내용 (건조 중량 기준)이 데모 40 % 정도로, 일반적으로 적당한 있습니다. 이것은 리그노셀룰로오스성 보조 세포 벽 내에 바운드 물 초과 공짜 물이 의미 소나무의 섬유 포화 점 (FSP) (일반적으로 24 % 정도) 이상입니다. 이것은 또한 일부 위킹 가능성이 발생하는 것을 의미합니다. 100 % RH 아직도 나무 MC는 FSP를 초과할 수 없습니다. 당신의 디자인은 기판과 메쉬 선택에 따라 다른 결과를 얻을 수 있습니다. 열쇠는 건조 중량 기준으로 85 % 또는 이렇게 아래에 수분 내용을 유지하는 것입니다.
- 이러한 한천 블록 microcosms의 저하 나무 %의 질량 손실은 대부분의 곰팡이 16 주 후에 일반적으로 약 30 %입니다. 선택 곰팡이 들어,이 경우 Serpula의 lacrymans에서 버섯이 시간에,> 60 %의 질량 손실을 전체 저하를 달성할 것입니다. S. lacrymans 작은 리그닌을 제거, 갈색 부패의 균류,이 재판에 이렇게 62 퍼센트의 질량 손실은 붕괴가 근처 또는 과거 완료있다는 것을 의미합니다. 화이트 부패의 곰팡이는 리그닌을 제거되며, 대량 손실이 종류뿐만 아니라 기판에 따라 달라집니다.
- hyphal 형태를 기록하는데주의를 기울여야. 이 예제에서, hyphal 형태 본질적으로 어느 한 치료에 성공 또는 실패를 표시하지 않았지만, melanization 색상이 중요했다. 우리가 기본 재료가 테스트되었으며이 '녹이'colorization가 관찰 어디로 외. 같은 이전 연구 (2000)에 석고의 불순물로서 철의 역할을 관계 수있었습니다. 칼슘과 철분의 역할에 낮은 외. (2000) 토론, 그리고 여기 우리는 철, 칼슘 강화하지 부패를 참조하고, 다음과 같은 적갈색 균사되었습니다.
- 이 저하 나무에 아무것도 농도를 측정하는 원한다면, 그것은 대량 손실 정상화하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 칼슘은 둘 다 가져오지 않거나 목재 수출, 50 %를 부식하는 경우 중량 기준으로 그 농도는 최종 수확에 시간 제로에서 더블로 나타납니다. 분말 1g 지금 시간이 제로에서했던 것보다 두 배 나무 볼륨을 나타냅니다 때문입니다. 곰팡이는 밀도를 감소, 매트릭스의 50 %를 소비. 다음과 같이 대량 손실을 보상하기 위해 어떠한 주어진 농도 (예 : mmol / g)을 정상화 :
표준 농도 = mmol는 / GX [1 - (% 질량 손실 / 100)]
예 : 10 mmol / 우드 저하 20 % g CA, 대 7 시간 제로 mmol / g.
질문 : 붕괴 중 칼슘 함량 증가나요?
10 mmol / g는 명백한 3 mmol / g 증가, 43 % 증가하지만, O는낮은 밀도 저하 나무 가루 NE의 g는 이제 더 큰 볼륨을 나타냅니다. 정규화는 같은 나무 볼륨의 초기 및 최종 칼슘 함량을 비교해야합니다.
10 × [1 X (20 % / 100)] = 8 mmol / g 표준
답 : 예, CA가 증가했지만, 14 %,하지 43%.
(데이터는 밀도에 의해 곱하여 나무 볼륨 mmol / cm 3 당 표현할 수있다.
그림 1. 아가르 블록의 소우주로 부화하기 전에이 예제에서 설정할 수 있습니다.
그림 2. 한천 - 접촉 위에 블록을 상승 플라스틱 메쉬에서 쉬고있는 파인 우드 블록을 colonizing Serpula의 lacrymans. 이 균사체가 나무와 외인성 영양소 / 요소 소스 사이의 중요한 연결을 대표하고, 한천 또는 고체 물질로서 이러한 외인성 물질 소스를 제어하는 것은 비교 토양 블록 설계, 한천 블록 설계의 주요 장점이라고 생각합니다.
그림 3. %의 체중 감소를 의미, 한천 블록 microcosms에 소나무 5 15 주 부화 후 Serpula lacrymans하여 목재 부패의 범위의 측정으로. 아무것도 (CA - 무료), 5 MM CaCl 2 한천 (CaCl 2) 치료를 추가 없었다> 99% 순수 석고 (카소 4), 또는 1 % 석고 철 - 수정. 보호 ANOVA는 비교가 α = 0.05와 Tukey의 테스트를 사용하고 있던 것을 의미합니다. 각 수확 들어, 같은 편지 아래에 막대가 크게 다를 수 없습니다. 오차 막대는 표준 편차 =. 실링 (2010)에 게시.
그림 4. 오버헤드 사진 (A) 모두 다섯가 같은 갈색 썩음 시험 균류, Serpula lacrymans뿐만 아니라 블록 (B) 제거 오븐 건조하여 부패의 주 15 복제합니다. CA - 무료 치료 melanization 부족을 참고 순수 칼슘 트리 트먼트에 yellowing, 그리고 철 - 개정된 치료에 녹 모양. 치료는 비교를 위해 (B)가 아닌 주사되는 블록에 제어, 그림 3에서와 같이 표시됩니다.
그림 5. 높은 철 농도 매체, 블레이 크 슬리의 맥아 한천을 사용하여 다른 재판에서 오버헤드 그림. 그림 4와 비교 관찰 melanization의 손실을합니다. 제거하고 무게 블록 체중 감량에는 치료 효과를 보여주지. 이것은이 블록 시험의 외인성 구성 요소의 영향을 시범으로 제공됩니다. 이러한 효과는 이러한 외인성 입력 컨트롤이 너무 어렵습니다 어디에, 토양 블록의 병 디자인에 testable되지 것입니다.
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Discussion
우리 한천 블록 설정 (그림 1)를 사용 Serpula lacrymans은 (그림 3 제어 갈색 - 부패 소나무 블록에 60 % 이상의 체중 감소로 이어지는, 석고 표면과 나무 블록 (그림 2)에 직접 접촉하는 성장 ). 이것은 쉽게> 50 %의 부패의 ASTM 표준 목표를 만족하고,에서 부패에 변화의 평균 계수 (C V)는 주 16 0.055했다. 이 데이터는 실링 7 게시됩니다. 다시 다른 곰팡이는 토양 블록보다 한천 블록에서 더 이상 부화가 필요합니다. 참고로, 우리는 성공적으로 자주 외인성와 연결을 확인하는 전자 흩어지는 분광법 (SEM - EDS) 및 유도 결합 플라즈마 분광법 (ICP - 관한 것)과 전자 현미경을 스캔 사용하는 다른 곰팡이 종의 다양한 여러 과거의 실험에서 유사한 디자인을 실행 기판과 나무 8,9에 칼슘 및 다른 요소의 translocation.
낮은 다양성뿐만 아니라, 우리의 한천 블록 디자인이 공개되는 두 결과가 없습니다. 첫째, 우리의 칼슘 첨가가, 한천 여부를하면 CaCl 2 또는 순수 석고로 본 균에 의해 손상을 저해 치료 효과 (그림 3)가 발생했습니다. 다른 칼슘은 박격포와 석고처럼 실제 자료와 연구에 따라 손상을 강화 이론 때문에 이것은 유용한 결과입니다. 대신, 우리는, 철, 칼슘 안을 제안, 붕괴 속도가 석고로 철분의 추가와 리바운드 볼 열쇠입니다. 두 번째 유용한 결과가 그러나, 계량 아니라 대신 mycelia의 색상 (그림 4)입니다. 이 트리 트먼트를 사이에 외부 균사의 중요하고 분명한 melanization 차이가 있고, 건축 자재에서이 곰팡이가 발생한 때 연구자들은 이전에 (예 : 낮은 외. 2000) '녹'melanization을 언급했습니다. 우리의 최근 연구에서 우리는 이러한 효과가 높은 철 매체 (그림 5)를 사용 손실됩니다 것으로 나타났습니다. 총체적으로,이 곰팡이는 '녹슨'mycelia와 이러한 자료 그리고 이전 연구에서, 철, 칼슘을 활용하지보고, 칼슘 철분 효과를 효과를 관찰하지다고 제안합니다.
전반적으로, 이러한 결과와 높은 철 한천을 사용하여 치료 효과의 부족은 한천 블록 디자인이 특히 대체 토양 블록 접근 방식에 비추어, 연구자를 제공할 수있는 컨트롤의 매우 강력한 시위입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dishes | Nalge Nunc international | 4014 | 25 x 150 mm |
| Agar, Type A | Sigma-Aldrich | A4550 | |
| Ammonium nitrate, NH4NO3 | Millinckrodt | 3436-12 | |
| Potassium phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 3246-01 | |
| Magnesium sulfate 7-hydrate, MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Dextrose |
| Boric acid, H3BO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 2549-04 | |
| Zinc sulfate 7-hydrate, ZnSO4•7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 8880-12 | |
| Manganous chloride 4-hydrate, MnCl2•4H2O | JT Baker | 2540-04 | |
| Copper(II) sulfate 5-hydrate, CuSO4•5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Ammonium heptamolybdate 4-hydrate, (NH4)6Mo7O24•4H2O | Sigma-Aldrich | 431346 | |
| Calcium chloride dihydrate, CaCl2•2H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 4160-12 | |
| Sodium chloride, NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581-12 | |
| Ferrous sulfate 7-hydrate, FeSO4•7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 5056-12 | |
| Pipet-aid | Drummond Scientific | 4-000-110 | Cordless EtOH the surface |
| 10 ml sterile polystyrene pipette | BD Biosciences | 357551 | |
| Gutter Guard | Thermwell Products Co. | VX620 | Pre-scrubbed with soap Hardware store |
| Calcium sulfate hemihydrate, CaSO4•0.5H2O | Acros Organics | 385355000 | |
| #4 cork borer | Boekel Scientific | 1601 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 |
References
- ASTM D1413-07. Standard test method for testing wood preservatives by laboratory soil-block cultures. . Annual Book of ASTM Standards. , 185-192 (2007).
- Bravery, A. F. A miniaturized wood block for the rapid evaluation of wood preservative fungicides. , International Research Group on Wood Protection (IRG/WP 2113). (1978).
- Low, G. A., Young, M. E., Martin, P., Palfreyman, J. W. Assessing the relationship between the dry rot fungus Serpula lacrymans and selected forms of masonry. Int. Biodeterior. Biodegrad. 46, 141-150 (2000).
- Nicolas, D. Volume I (One/1) - Degradation and Protection of Wood (Syracuse Wood Science Series #5). Wood Deterioration and Its Prevention by Preservative Treatments. , Syracuse University Press. (1973).
- Schilling, J. S. Effects of calcium-based materials and iron impurities on wood degradation by the brown rot fungus Serpula lacrymans. Holzforschung. 64, 93-99 (2010).
