Protocole pour des essais de l'ARNi dans les moustiques adultes (A. gambiae)

Summary

Inverse des approches génétiques se sont avérées extrêmement utiles pour déterminer quels gènes de résistance sous-tendent à des agents pathogènes vecteurs de moustiques. Ce protocole vidéo illustre une méthode utilisée par le laboratoire Dimopoulos à injecter dans les ARNdb Anopheles gambiae moustiques, qui abritent le parasite du paludisme. La technique de manipulation de l'installation d'injection et injection ARNdb dans le thorax est illustré.

Abstract

Inverse des approches génétiques se sont avérées extrêmement utiles pour déterminer quels gènes de résistance sous-tendent à des agents pathogènes vecteurs de moustiques. Ce protocole vidéo illustre une méthode utilisée par le laboratoire Dimopoulos à injecter dans les ARNdb Anopheles gambiae moustiques, qui abritent le parasite du paludisme. La technique de manipulation de l'installation d'injection et injection ARNdb dans le thorax est illustré.

Protocol

Silençage génique médiée par ARNi chez les moustiques nécessite une préparation préalable et la purification de dsRNA spécifiques qui ciblent le gène d'intérêt. Pour la synthèse ARNdb, nous recommandons le kit Megascript Ambion qui rend l'utilisation d'un ARN polymérase T7 médié réaction de transcription in vitro. Pour la purification ARNdb, nous recommandons le kit Qiagen RNeasy. Des échantillons d'ARNdb doivent être quantifiées et ajusté à 3 pg / pl dans l'eau…

Discussion

Efficacité de l'inactivation du gène est très variable et dépend d'un certain nombre de facteurs, dont la transcription et des protéines turn-over des taux, et l'efficacité d'absorption ARNdb par les cellules et les organes. Nous avons trouvé que l'inhibition commence dès le 1er jour après l'injection et peut durer jusqu'à 6 jours après l'injection. Utiliser des méthodes de détection et de la transcription des protéines telles que la PCR quantitative et Western blot pour valider taire.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Megascript	kit	Ambion		for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy		Qiagen		For dsRNA purification
dsRNA				should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water
fine-tipped forceps
glass slide
glass microcapillary needles
microinjector		Drummond	Nanoject II
light microscope				mounted above a cold block
Petri dish				covered, glass
paper towels
10% sucrose	food
A. gambiae	Animal			mosquitos