Protocolo para Ensaios RNAi em mosquitos adultos (A. gambiae)

Summary

Reversa abordagens genéticas têm-se revelado extremamente útil para determinar quais genes de resistência a patógenos underly vetor em mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra um método utilizado pelo laboratório Dimopoulos para injetar dsRNA em mosquitos Anopheles gambiae, que abrigam o parasita da malária. A técnica de manipular a configuração da injeção e injetar dsRNA no tórax é ilustrado.

Abstract

Reversa abordagens genéticas têm-se revelado extremamente útil para determinar quais genes de resistência a patógenos underly vetor em mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra um método utilizado pelo laboratório Dimopoulos para injetar dsRNA em mosquitos Anopheles gambiae, que abrigam o parasita da malária. A técnica de manipular a configuração da injeção e injetar dsRNA no tórax é ilustrado.

Protocol

RNAi mediada silenciamento de genes em mosquitos exige preparação prévia e purificação de dsRNAs específicos que visam o gene de interesse. Para a síntese de dsRNA, recomendamos o kit Megascript Ambion que faz uso de uma RNA polimerase T7 mediada por reação in vitro de transcrição. Para a purificação de dsRNA, recomendamos o kit Qiagen RNeasy. Amostras de dsRNA devem ser quantificados e ajustado a 3 mcg / mL em água. Outros materiais que você vai precisar incluir: com pontas finas pinças, lâmin…

Discussion

Eficiência do silenciamento do gene é altamente variável e depende de uma série de fatores, incluindo transcrição e proteínas turn-over, as taxas de absorção e eficiência dsRNA pelas células e órgãos. Descobrimos que o silenciamento começa tão cedo quanto uma injeção de pós dia e pode durar até seis dias após a injecção. Utilização de métodos de detecção de transcrição e proteínas, tais como PCR quantitativo e Western blotting para validar silenciar.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Megascript	kit	Ambion		for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy		Qiagen		For dsRNA purification
dsRNA				should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water
fine-tipped forceps
glass slide
glass microcapillary needles
microinjector		Drummond	Nanoject II
light microscope				mounted above a cold block
Petri dish				covered, glass
paper towels
10% sucrose	food
A. gambiae	Animal			mosquitos