成蚊（冈比亚按蚊的RNAi实验议定书）

Summary

反向遗传方法已被证明非常有用，确定哪些基因底层电阻载体病原体在蚊子。该视频协议说明Dimopoulos实验室使用的冈比亚按蚊的蚊子，其中海港的疟疾寄生虫注入dsRNA的一个方法。操纵注射的设置和注入胸廓的dsRNA的技术说明。

Abstract

反向遗传方法已被证明非常有用，确定哪些基因底层电阻载体病原体在蚊子。该视频协议说明Dimopoulos实验室使用的冈比亚按蚊的蚊子，其中海港的疟疾寄生虫注入dsRNA的一个方法。操纵注射的设置和注入胸廓的dsRNA的技术说明。

Protocol

RNAi介导的基因沉默在蚊子需要事前准备和提纯感兴趣的基因的具体dsRNAs目标。双链RNA的合成，我们建议Ambion公司Megascript套件，这使得使用一个T7 RNA聚合酶介导的体外转录反应。对于纯化的双链RNA，我们建议Qiagen公司的RNeasy试剂​​盒。双链RNA的样品应量化，并调整为3微克/μL在水中。其他材料，您需要包括：细尖镊子，载玻片，玻璃microcapillary针，微量（我们使用Drummond的Nanoject第二），?…

Discussion

基因沉默的效率是高度可变的，取决于多项因素，包括成绩单和蛋白质的转，超过利率，并通过细胞和器官的双链RNA吸收效率。我们发现，沉默开始早在1天注射后，可长达6天注射后。使用成绩单和蛋白质的检测方法，如定量PCR和Western印迹，以验证沉默。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Megascript	kit	Ambion		for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy		Qiagen		For dsRNA purification
dsRNA				should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water
fine-tipped forceps
glass slide
glass microcapillary needles
microinjector		Drummond	Nanoject II
light microscope				mounted above a cold block
Petri dish				covered, glass
paper towels
10% sucrose	food
A. gambiae	Animal			mosquitos