تحليل الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام الأجهزة Cryosections مضغي الشكل
Summary
الخلايا الجذعية المحفزة المتنامي في تعليق تفرق في الهيئات مضغي الشكل (EBS). نحن هنا لشرح كيفية الحصول على جودة عالية cryosections EB مفيدة لدراسة الجوانب الخلوية والجزيئية لمرحلة التطور الجنيني ، مع الحفاظ على مؤسساتهم والمجاميع.
Abstract
الجذعية الجنينية (ES) الخلايا هي الخلايا المحفزة المستمدة من كتلة الخلايا الداخلية للأجنة في مرحلة الكيسة أوائل الثدييات 1. مرحلة حاسمة في التفريق بين الخلايا وفاق هو تشكيل هيئات مضغي الشكل (EBS) المجاميع 2 ، 3. ويستند تشكيل المجلس التنفيذي على تجميع عفوية عندما يتم استزراع خلايا ES في لوحات غير ملتصقة. يلخص EB ثلاثي الأبعاد جوانب كثيرة من الثدييات الجنيني المبكر ، والتفريق في الطبقات الجرثومية الثلاث : الأديم الظاهر ، الأديم المتوسط والأديم الباطن 4.
وتستخدم على نطاق واسع والمناعي في الموقع التهجين التقنيات للكشف عن الهدف والبروتينات الموجودة في خلايا مرنا من قسم النسيج 5 ، 6 ، 7. نقدم هنا تقنية بسيطة لتوليد cryosections عالية الجودة للهيئات مضغي الشكل. هذا النهج يعتمد على التوجه المكاني لتضمين EB في أكتوبر تليها تقنية cryosection. يمكن أن يتعرض المقاطع مما أدى إلى طائفة واسعة من الإجراءات التحليلية من أجل تميز السكان من الخلايا التي تحتوي على بروتينات معينة ، أو الحمض النووي الريبي DNA. في هذا المعنى ، وإعداد cryosections EB (10μm) هي الأدوات الأساسية للتحليل تلطيخ الأنسجة (مثلا Hematoxilin ويوزين ، دابي) ، المناعي (مثل Oct4 ، nestin) أو التهجين في الموقع. هذه التقنية يمكن أن يساعد أيضا في فهم جوانب من مرحلة التطور الجنيني فيما يتعلق بالحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد كروية EBS.
Protocol
Discussion
الأسلوب الموصوفة هنا يوفر وسيلة سهلة لمتابعة بروتوكول للحصول على أبواب ثابتة PFA ناظم البرد رقيقة من الهيئات مضغي الشكل مفيدة للالمناعي والمقايسات التهجين الموقع. وcryosections الناتجة تسمح بدراسة الجوانب الخلوية والجزيئية للخلايا الجذعية الجنينية البشرية الت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل قرينتها دي أمبارو a Pesquisa تفعل استادو دو ريو دي جانيرو (FAPERJ) ، ناسيونال دي Conselho Desenvolvimento Científico تكنولوجيكو ه (CNPq) والمعهد الوطني للبحوث والتكنولوجيا Ciência ه (INCTC). ونحن ممتنون لبرونا S. M. بولسن وألين فرنانديز للصور EB.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | TPP | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
- Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, 88-95 (2000).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).
- Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells. Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).
- Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Mol Cells. 24, 76-82 (2007).
- Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).
- Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies. Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).
- Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating. Histochemistry. 77, 275-279 (1983).
- Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats. Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).
