Pluripotenta stamceller växer i suspension differentieras till embryoid organ (EBS). Här visar vi hur du får hög kryosnitt kvalitet EB användbart för att studera cellulära och molekylära aspekter av embryogenes, samtidigt som deras organisation som aggregat.
Embryonala stamceller (ES-celler) är pluripotenta celler som härrör från den inre cellmassan i blastocysten steg tidiga däggdjur embryon 1. En avgörande fas i differentiering av ES-celler är bildandet av embryoid organ (EBS) aggregat 2, 3. EB formation är baserad på spontana aggregering när ES-celler odlas i icke vidhäftande plattor. Tredimensionella EB rekapitulerar många aspekter av tidiga däggdjur embryogenesen och differentierar till de tre groddblad: ektoderm, mesoderm och endoderm 4.
Immunofluorescens och in situ hybridisering används ofta tekniker för att upptäcka målproteiner och mRNA som finns i celler i en vävnad avsnitt 5, 6, 7. Här presenterar vi en enkel teknik för att generera hög kvalitet kryosnitt av embryoid organ. Detta synsätt bygger på rumslig orientering EB ingjutning i oktober följt av cryosection teknik. Den resulterande delarna kan utsättas för en mängd olika analysmetoder för att karaktärisera populationer av celler som innehåller vissa proteiner, RNA eller DNA. I denna mening, beredning av EB kryosnitt (10μm) är viktiga verktyg för histologi färgning analys (t.ex. Hematoxilin och Eosin, DAPI), immunofluorescens (t.ex. Oct4, nestin) eller in situ hybridisering. Denna teknik kan också hjälpa till att förstå aspekter av embryogenesen med avseende på underhållet av det tredimensionella sfäriska struktur EBS.
Den metod som beskrivs här ger en enkel att följa protokollet för att få PFA fast tunna kryostatsnitt av embryoid organ användbar för immunofluorescens och in situ hybridisering analyser. Den resulterande kryosnitt tillåter studier av cellulära och molekylära aspekter av mänskliga embryonala stamceller differentiering, samtidigt som deras struktur och organisation som aggregat.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Fundação de Amparo en Pesquisa gör Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) och Instituto Nacional de Ciencia e Tecnologia (INCTC). Vi är tacksamma för Bruna S. Paulsen och Aline M. Fernandes för EB bilder.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P2636 | 200mg/mL in water |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura | P2636 | |
Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
Conic Tube | Tool | TPP | 91015 | 15mL conic tube |
Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
Cryostat | Tool | Leica | CM 1850 | |
Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |