Oligonukleotide können die Besucher genutzt werden speziell Ersatz eines einzelnen Nukleotids von transfizierten Zielgene in beiden Anopheles gambiae Und Anopheles stephensi Zellen.
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Methodenartikel
Transfektion und Mutagenese von Zielgenen in Mosquito-Zellen durch Locked Nucleic Acid-modifizierte Oligonukleotide
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Plasmodium Parasiten, der Erreger der Malaria, durch den Stich infizierter Anopheles-Mücken sich in mehr als 250 Millionen Neuinfektionen pro Jahr übertragen. Trotz jahrzehntelanger Forschung gibt es noch keinen Impfstoff gegen Malaria, die die Notwendigkeit für neue Bekämpfungsstrategien. Ein innovativer Ansatz ist die Verwendung von gentechnisch veränderten Mücken wirksam zu kontrollieren Malaria-Parasiten-Übertragung. Absichtliche Veränderungen der Zell-Signalwege in der Mücke, durch gezielte Mutagenese, haben sich Parasiten Entwicklung 1 zu regeln. Aus diesen Studien, können wir beginnen, um potenzielle Gen-Targets für die Transformation zu identifizieren. Durch gezielte Mutagenese wurde traditionell auf die homologe Rekombination zwischen einem Zielgen und ein großer DNA-Molekül verlassen. Allerdings ist der Aufbau und die Verwendung solcher komplexer DNA-Moleküle für die Erzeugung von stabil transformierten Zelllinien kostspielig, zeitaufwändig und oft ineffizient. Daher stellt eine Strategie mit gesperrten Nukleinsäure-modifizierte Oligonukleotide (LNA-ons) eine sinnvolle Alternative für die Einführung von künstlichen single nucleotide Substitutionen in episomalen und chromosomale DNA Gen-Targets (reviewed in 2). LNA-ON-vermittelte gezielte Mutagenese wurde verwendet, um Punktmutationen in Genen von Interesse in kultivierten Zellen von Hefe-und Mäuse 3,4 einzuführen. Wir zeigen hier, dass LNA-ONs verwendet werden, um ein einzelnes Nukleotid Änderung in einer transfizierten episomalen Ziel, das in einem Wechsel von blau fluoreszierenden Protein (BFP) zum Ausdruck grün fluoreszierende Protein (GFP)-Expression in beiden Anopheles gambiae und Anopheles stephensi Zellen führt einzuführen . Diese Umwandlung zeigt zum ersten Mal, dass eine wirksame Mutagenese von Zielgenen in Mücke-Zellen durch LNA-ons können vermittelt werden, und schlägt vor, dass diese Technik kann für Mutagenese von chromosomalen Ziele in vitro und in vivo.
Protokoll
- Vor dem Start des Protokolls ist es wichtig, festzustellen, dass die Mücke Zellen im Experiment verwendeten gesund sind und bei ~ 80% Konfluenz, wenn Anhänger (Abbildung 1). Overgrown oder kranken Zellen wird in geringer Transfektionseffizienz führen und inkonsistente Ergebnisse liefern.
- Warm up alle Medien vor, in einem 28 ° C Wasserbad für 30 Minuten verwenden.
- A. stephensi MSQ43 Zellen benötigen E5 Medium: MEM, Earle w / Glutamin, 5% hitzeinaktiviertem FCS, 0,2% D-Glucose, 1% Penicillin-Streptomycin Antibiotikum, und 1% nicht-essentiellen Aminosäuren.
- A. gambiae SUA5B Zellen benötigen S2 Medium: Schneiders Drosophi....
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Diskussion
Hier präsentieren wir ein in vitro Verfahren und Beweise für die gezielte Umwandlung von einem einzigen Nukleotid in einem episomalen Gen Ziel nach der Transfektion von LNA-ons in A. stephensi und A. gambiae Zellen. LNA-ON-vermittelte Gen-Konvertierung erfordert Induktion einer ortsspezifischen DNA-Reparatur-Reaktion, unsere Daten zeigen, dass Moskito-Zellen können diesen Mechanismus für die ortsspezifische Mutagenese zu unterstützen. Während die hier vorgestellte Methode auf Umwandlung einer .......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir möchten Abbie Spinner an der California National Primate Research Center für ihre Unterstützung bei der Durchflusszytometrie danken. Diese Studie wurde durch Mittel aus dem National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) der National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799 und AI078183 unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Effectene-Transfektionsreagenz | Qiagen | 301425 | |
| GFP-Kontrollplasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | |
| BFP-Plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Geschenk von Dr. Concordet3 | ||
| LNA-ONs | Geschenk von Dr. Concordet3 | ||
| MEM, Earle’s mit Glutamin | Invitrogen | 11095 | |
| Fötales Kälberserum (FCS) | Invitrogen | 16000 | |
| Schneider’s Drosophila-Medium | Invitrogen | 11730 | |
| Nicht-essentielle Aminosäuren | Invitrogen | 11140 | |
| 10% D-Glukose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Penicillin-Streptomycin-Antibiotikum | Invitrogen | 15140 | |
| 6-Loch-Kulturschalen | Corning | 3516 |
Referenzen
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R.
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Nachdrucke und Genehmigungen
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