एक आयन चैनल चतुर्थ आवृत्ति घटक का प्रयोग वक्र के पुनर्कथन
Summary
एक साथ कई आयन चैनलों के माध्यम से वर्तमान प्रवाह को मापने के लिए तकनीकी बाधाओं रहे हैं, और बाद समझदार transmembrane वर्तमान की भाग क्या प्रत्येक चैनल प्रकार के कारण है. इस की जरूरत है पता करने के लिए, इस पद्धति का एक विशिष्ट आवृत्ति घटकों का उपयोग कर व्यक्तिगत चैनल प्रकार के चतुर्थ वक्र उत्पन्न प्रस्तुत करता है.
Abstract
INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.
METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.
RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|<0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.
Protocol
Discussion
तकनीकी बाधाओं है कि वर्तमान में कई आयन चैनल प्रकार के बाद कितना मौजूदा प्रत्येक चैनल प्रकार के लिए जिम्मेदार ठहराया जाना चाहिए का निर्धारण करने के इरादे के साथ एक साथ मापने से शोधकर्ताओं को रोकने रहे हैं. इस सीमा के कारण, आयन चैनलों को आमतौर पर व्यक्तिगत अध्ययन कर रहे हैं वोल्टेज, वर्तमान, और कार्रवाई की क्षमता दबाना जैसे तकनीकों का उपयोग 1. व्यक्तिगत चैनल प्रकार, heterologous अभिव्यक्ति प्रणालियों अक्सर इस्तेमाल किया जाता का अध्ययन. 2 जब ऊतकों से अलग cardiomyocytes जैसे कोशिकाओं के साथ काम करना अन्य साधनों के विभिन्न आयन चैनल ब्लॉक करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, सोडियम चैनल एक धीमी depolarizing वोल्टेज रैंप के द्वारा निष्क्रिय किया जा सकता है है, 3 आवक सुधार पोटेशियम चैनलों BaCl2 कोशिकी के साथ अवरुद्ध किया जा सकता है, 4, और कैल्शियम चैनल verapamil का उपयोग अवरुद्ध किया जा सकता 5.
एक विधि का इस्तेमाल किया है कि आंशिक रूप से इस सीमा पर काबू पा दो चैनलों प्रकार के माध्यम से वर्तमान प्रवाह के साथ तो, को मापने के चुनिंदा एक उपयुक्त एजेंट के साथ एक चैनल प्रकार अवरुद्ध करने के बाद माप दोहराने है. दो माप की घटाना तो चैनल प्रकार है कि अवरोधित किया गया था करने के लिए वर्तमान कारण की राशि का अनुमान किया जा सकता है 6. हालांकि, इस तकनीक के लिए दो प्रमुख सीमाएं हैं . सबसे पहले, कि चुनिंदा प्रत्येक आयन चैनल को ब्लॉक कर सकते हैं रासायनिक एजेंटों नहीं किया गया है की पहचान की है, और कुछ व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दवाओं अन्य चैनल प्रकार के साथ गैर विशिष्ट बातचीत है 5,7 दूसरा, यह इस तकनीक से निर्धारित नहीं कर सकते हैं कि एक चैनल किसी अन्य के द्वारा modulated है चैनल. उदाहरण के लिए, NAV 1.5 और 2.1 कीर की विषम अभिव्यक्ति गिनी पिग निलय में दिखाया गया है, और यह सुझाव दिया गया है कि एक synergistic रिश्ता दो चैनलों के बीच मौजूद है, ऐसी है कि सही वेंट्रिकल में उच्च कीर 2.1 अभिव्यक्ति प्रवाहकत्त्व वेग depresses. 8 वर्तमान में , यह सत्यापित नहीं किया जा सकता है.
इस अध्ययन में, हम बताते हैं कि प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी एकाधिक आयन चैनल एक साथ मापा प्रकार के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है. हालांकि प्रस्तुत विधि धाराओं के लिए दो चैनल एक साथ मापा प्रकार से विचार किया गया कभी नहीं इस्तेमाल किया गया है, प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी आयन चैनल समारोह के अन्य पहलुओं के एक नंबर का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. Goodman और कला कछुआ श्रवण बालों की कोशिकाओं है कि वर्तमान प्रोटोकॉल दबाना विभिन्न आवृत्तियों के लिए एक सेल धुन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, और transmembrane क्षमता में दोलनों एक आवक सुधार + K चैनल और एक Ca 2 + चैनल के बीच एक परस्पर क्रिया के कारण है का उपयोग कर दिखाया. 9 हान और Frazier दिखा दिया प्रतिबाधा आवृत्तियों की एक विस्तृत श्रृंखला (100 हर्ट्ज 5 मेगाहर्ट्ज) पर एक एकल कक्ष में मापा जा सकता है, और प्रतिबाधा में वृद्धि मनाया जब कश्मीर + या Ca 2 + चैनलों अवरुद्ध किया गया एक सरल साधन हो सकता है उच्च throughput दवा स्क्रीन में चैनल ब्लॉक का पता लगाने के 10 हयाशी धीवर और जटिल प्रवाहकत्त्व का इस्तेमाल किया है एक आवक सुधार + K चैनल 11 अन्य समूहों अलग चैनल प्रकार की वोल्टेज क्लैंप प्रोटोकॉल में एक एकल आवृत्ति में डाला है और गतिज गुणों का अध्ययन से पता चला है कि मनाया आवृत्ति प्रतिक्रिया कुछ आवृत्तियों लेकिन दूसरों को नहीं के लिए उम्मीद की प्रतिक्रिया के साथ सहमत 12,13 Millonas और Hanck कारण कुछ आवृत्तियों का उत्पादन नहीं किया उम्मीद प्रतिक्रिया मार्कोव मॉडल में एकाधिक दर स्थिरांकों का उपस्थिति है का सुझाव दिया है इस तरह के रूप में इन 12 अध्ययन. के रूप में अच्छी तरह से दूसरों के रूप में प्रदर्शन, है कि वहाँ उदाहरण है जब ईओण आयन चैनल से मापा जबकि प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग धाराओं सैद्धांतिक आवृत्ति प्रतिक्रिया के साथ सहमत नहीं हैं. इस अध्ययन में यह एक चिंता का विषय है क्योंकि इस अध्ययन में विधि का उद्देश्य आवृत्तियों कि वर्तमान झिल्ली बिजली के सर्किट के अंतर्निहित मान्यताओं के स्वतंत्र आयाम के साथ सहसंबंधी की पहचान नहीं है. Furtheremore, वर्तमान आयाम रिकॉर्डिंग है कि किसी भी शोर उन में सम्मिलित कार्य नहीं है के कुछ भागों से गणना की है. अन्य अध्ययनों के एक नंबर भी कई आयन चैनल की वर्तमान मॉडल अपने स्वयं के दर स्थिरांकों के साथ सभी के संचालन और गैर प्रवाहकत्त्व के कई राज्यों का प्रदर्शन 14,15,16 थॉम्पसन एट अल पता चला है कि KcsA चैनल के चयनात्मकता फिल्टर बाध्यकारी साइटों के लिए अलग ना है. + ली + और + कश्मीर, और दूसरे के लिए एक बाध्यकारी साइट से चयनात्मकता फिल्टर के माध्यम से एक आयन कदम के रूप में आगे बढ़ के ऊर्जावान लागत है क्या चैनल preferentially अपने ताकना के माध्यम से + K आयनों का संचालन करता है इस पत्र में 17 हम एक सीमा डाला एक वोल्टेज कदम प्रोटोकॉल में आवृत्तियों (शोर समारोह) और आवृत्तियों जिसका आयाम अत्यधिक समग्र वर्तमान आयाम के साथ सहसंबंधी के लिए देखा. के बाद से मजबूत सबूत सुझाव प्रस्तुत किया गया है एकाधिक दर स्थिरांक differen के माध्यम से आयनों के चालन में एक भूमिका निभाटी चैनलों, इन दर स्थिरांक के साथ जुड़े आवृत्तियों की शुरूआत कुछ आवृत्तियों resonate या अत्यधिक वर्तमान आयाम है, जो अन्यथा नहीं होता के साथ सहसंबंधी कारण हो सकता है. इस अध्ययन में तकनीक का प्रदर्शन एक मॉडल सेल है, जो एक समानांतर आर सी सर्किट है कि आम तौर पर वोल्टेज क्लैंप circuitry और अधिग्रहण के उपकरण का परीक्षण किया है पर किया जाता है. यह उम्मीद है कि डीसी के अलावा किसी भी आवृत्तियों वर्तमान परिमाण के साथ सहसंबंधी नहीं है, और यह हमारे डेटा में दिखाया गया है. हम यह भी पता चलता है कि शोर समारोह के अलावा किसी भी आवृत्तियों उच्च वर्तमान आयाम के साथ सहसंबंधी करने के लिए कारण नहीं था. इन दो निष्कर्ष महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वे बताते हैं कि माप उपकरण और शोर समारोह स्वयं द्वारा किसी भी आवृत्तियों वर्तमान आयाम के साथ सहसंबंधी करने के लिए कारण नहीं है. जब भविष्य के अध्ययन आयन चैनल युक्त झिल्ली माप का उपयोग कर बनाने के लिए, यह उम्मीद है कि, प्रयुक्त चैनल पर निर्भर करता है, आवृत्तियों कि चयनात्मकता फिल्टर या संभवतः ताकना में स्थिरांक दर के अनुरूप चैनल की आवृत्ति प्रतिक्रिया को प्रभावित और प्रभावित जो आवृत्तियों उच्च या वर्तमान आयाम के साथ कम सहसंबंध.
चूंकि इस पद्धति आयन चैनल के अध्ययन के लिए एक नई तकनीक है, वहाँ दिशाओं का एक संख्या भविष्य के अध्ययन का पालन कर सकते हैं. सबसे पहले, इस तकनीक के लिए विशिष्ट अलग चैनलों की आवृत्ति प्रतिक्रिया विशेषताएँ किया जाना चाहिए. अतिरिक्त कार्य भी वर्तमान आयाम आवृत्ति amplitudes जांचना किया जाना चाहिए. एक बार कई चैनलों को अलग – अलग विशेषता है, एक साथ कई चैनल प्रकार से मापा जाना चाहिए. तकनीक भी संभावित कार्रवाई क्लैंप, वर्तमान दबाना, और क्षेत्र उत्तेजना अध्ययन में इस्तेमाल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है है. हालांकि यह एक नई तकनीक है, यह पता चलता है क्या electrophysiological माप है कि पहले संभव नहीं थे बनाने के लिए और आयन चैनल के शारीरिक भूमिका में मूल्यवान नए अंतर्दृष्टि प्रदान के लिए एक शक्तिशाली तरीका हो सकता है है.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम स्वास्थ्य अनुदान R21-HL094828-01 की संख्या राष्ट्रीय संस्थानों डा. Poelzing के लिए सम्मानित किया गया द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Matlab | Mathworks | n/a | Natick, MA | |
| Clampex 8 | Molecular Devices | Clampex 8 | Sunnyvale, CA | |
| Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200 | Sunnyvale, CA | |
| Headstage | Molecular Devices | CV202 | Sunnyvale, CA | |
| 16-Bit Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1322A | Sunnyvale, CA | |
| Model Cell | Molecular Devices | Patch 1 Model Cell | Sunnyvale, CA |
References
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