Повторение ионный канал Кривая IV Использование частотных составляющих

Summary

Есть технические препятствия для измерения тока потока через несколько ионных каналов одновременно, а затем и взыскательных, какая часть трансмембранного тока из-за каждого канала типа. Чтобы удовлетворить эту потребность, этот метод представляет собой способ создания кривой IV отдельных видов канал с помощью конкретных частотных составляющих.

Abstract

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.

METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.

RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|<0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.

Protocol

1. Подготовка Функция шума и входного сигнала Создать шума функции, содержащей нужные компоненты частоты. Это может быть сделано путем описания желаемого частотных составляющих в частотной области, а затем расчета обратного быстрого преобразования Фурье. В этом исследовании, 1 – 15 кГц была использована. Все преобразования Фурье и обратное преобразование Фурье, описанных в данном исследовании, были рассчитаны с использованием БПФ Matlab и IFFT функций. Шкала амплитуда шума функции надлежащим образом. В этом исследовании шума функция масштабируется так, что от нуля до пика амплитуды шума функция была 50 или 100 мВ. Создать стимулы файл, используя методы подходят для приобретения программного обеспечения используется. Для CLAMPEX 8, сначала создайте текстовый файл с соответствующим заголовком. Ниже заголовка, вставка времени надбавок за одним движением в первой колонке. Приращениях времени должны иметь те же временные расстояния как интервал выборки, используемые в измерениях. Для каждой развертки в напряжении протокол шаг вставить точные напряжения желаемого на каждом шаге по времени. Это должно включать шум функции. 2. Выполните измерения напряжения зажим Создание протокола измерений в приобретение программного обеспечения, совместимого с стимул файла, созданного ранее. В CLAMPEX, есть меню, которое позволяет пользователю связать стимул файл с текущего протокола. Приложите модель (или биологическое) ячейки измерительного оборудования. Выполните эксперимент, как запланировано. Для целей контроля, не забудьте включить периодических измерений, которые не содержат никакого шума функций. 3. Анализ Сообщение Эксперимент Рассчитать кривую IV для отдельных записи. Если запись в равновесном состоянии, когда шум применяется функция, кривая IV можно создать с помощью устойчивая часть состояния записи временно за пределами диапазона шума функции. Если запись не была в равновесном состоянии, шум функция может вмешиваться в расчет кривой IV, так что вторая запись должна производиться без шума функция присутствует. Для каждого напряжения шаг в записи расчета быстрого преобразования Фурье часть записи, где шум функция была вставлена. Комбинат преобразование Фурье для каждого напряжения шаг в amxn матрицы, где т-число частот в БПФ, а п-число ступеней напряжения. В этой конфигурации, каждая строка матрицы представляет собой амплитуду одной частоты на всех ступеней напряжения в эксперименте. Для каждой частоты (то есть каждая строка в приведенном выше матрицы) коррелируют ряд с кривой IV генерируется в 3,1 и записывать коэффициент корреляции. Участок против коэффициент корреляции частоты для визуализации частот, которые сильно коррелируют с кривой IV. Так как постоянная составляющая содержится в первой частоте БПФ, коэффициент корреляции для этой частоты должна всегда быть> 0,99. 4. Представитель Результаты: Представитель измерения напряжения зажим показаны для модели клетки без (рис. 1А) и с (рис. 1В) шум функция вставляется в напряжении протокол шаг. Кривая IV был также рассчитаны для модели клетки (рис. 1в). Для каждой развертки, в записях из рисунка 1, БПФ был рассчитан по времени кадр, где шум функция была включена (см. красную коробку на рисунках 1А, 1Б). Цифры 2А и 2В показывают БПФ рассчитаны для записи показано на рисунке 1А и 1В, соответственно. После визуального осмотра, постоянная составляющая (выделено красным) появляется, чтобы имитировать форму кривой IV. Без шума функции, все частоты выше DC-видимому, амплитуда близка к нулю (рис. 2А). Когда шум Функция вставляется, частоты от 1 до 15 кГц имеют визуально заметные амплитуды (рис. 2В). На рисунке 3 показан результат соотнесения отдельных амплитуд частот в диапазоне напряжения шаги против кривой IV. На рис.3-C показывает, коэффициенты корреляции, когда эксперимент был проведен под контролем условиях (без шума функции) и с шумом амплитуды 50 и 100 мВ, соответственно. Обратите внимание, во всех случаях, постоянная составляющая появляется соотнести почти идеально совпадает с кривой IV. Действительно, для всех записей, коэффициент корреляции для этой частоты было больше, чем 0,99 (R = 0,9996 ± 1E-5, среднее ± стандартное отклонение). Когда мы смотрим на рисунок 3А (контроль условий), Есть нет частот, кроме постоянной составляющей, амплитуда которого значительно коррелирует с кривой IV. В частности, ни одна из этих частот имеют коэффициенты корреляции больше 0,5. При вставке из самых низких функцией амплитуды шума (50 мВ), эти же частоты еще коэффициентов корреляции менее 0,5. Коэффициенты корреляции длятаковой частоты также не стал более 0,5 когда амплитуда шума был увеличен до 100 мВ. . Рисунок 1 Модель сотового Recordings: Напряжение записи зажима приведены для модели клетки без (1А) и с (1В) шума функции, включенные в протокол шагового напряжения. Для первых и последних 20 мс каждой развертки, потенциал сохранился на проведение потенциала (0 мВ). Каждый шаг был напряжением 80 мс долго, и шум функция была включена 40 мс после начала шаг. Функция шума был продолжительностью 30 мс и содержащиеся частотах от 1 до 15 кГц. Напряжение было шагнул в сторону, от -150 до +50 мВ в 5 мВ шагом. Кривая IV для модели ячейка также показано (1С). Для того, чтобы записи легче читать, только каждый пятый развертки был включен в 1А и 1В, но все это проносится были включены в 1С. Рисунок 2 БПФ Recordings. БПФ был рассчитан для 30 мс часть каждой развертки, где шум функции должен быть вставлен (площадь, ограниченная красными окно на рисунках 1А, 1Б). Цифры 2А и 2В показывают БПФ рассчитан без учета и с шумом функции, соответственно. Еще раз, для ясности, только БПФ от каждого пятого развертки включается в цифру, но все это проносится были использованы в будущих расчетах. На рис. 3 IV Частота корреляции: результаты корреляции между кривой IV от записи и амплитуды отдельных частот в диапазоне ступеней напряжения показана. Цифры 1А – 1C показывают коэффициент корреляции для частот от 0 до 20 кГц под контролем условиях и в присутствии 50 или 100 мВ функций шума, соответственно. Рисунок 4 воссоздание Кривая IV:. Кривая IV для модели клетки (так же как показано на рисунке 1C) и величины двух частотах были наложены. Первая частота была постоянная составляющая (R = 0,995), а второй был случайно выбранных частот с низкой корреляции (R = 0,3212). Частота амплитуды были сокращены примерно одинаковую амплитуду, как кривая IV.

Discussion

Есть технические препятствия, которые в настоящее время предотвратить исследователей из измерения различных типов ионных каналов одновременно с намерением последующего определения того, сколько тока должны быть отнесены к каждому каналу типа. Из-за этого ограничения, ионные каналы обычно изучаются по отдельности, используя методы, такие как напряжение, ток, и потенциал действия зажима. ¹ Для изучения отдельных типов каналов, гетерологичных выражение системы часто используются. ² При работе с клетки, выделенные из тканей, таких как кардиомиоциты , другие средства должны быть использованы для блокирования различных ионных каналов. Например, натриевые каналы могут быть инактивируется медленным деполяризующего напряжения рампы, ³ внутрь исправления калиевых каналов может быть заблокирован с внеклеточной BaCl2, ⁴ и кальциевые каналы могут блокироваться по верапамил ^5.

Один метод, который частично преодолевает это ограничение для измерения тока потока по двум каналам одновременно типов, а затем повторите измерение после выборочной блокировки один канал типа с помощью соответствующего средства. Вычитание двух измерений могут быть использованы для оценки количества тока связано с каналом типа, который был заблокирован. ⁶ Тем не менее, Есть два основных ограничения для этой техники. Во-первых, химические вещества не были выявлены, которая может выборочно блокировать друг ионного канала, и некоторые широко используемые препараты неспецифического взаимодействия с другими типами каналов. ^5,7 Во-вторых, она не может быть определена по этой технике ли один канал модулируется другим канала. Например, гетерогенный выражение NaV 1,5 и 2,1 Кир был показан в желудочки морских свиней, и было высказано предположение, что синергетический связь существует между двумя каналами, например, что более высокие Кир 2,1 выражение в правый желудочек угнетает проводимость скорости. ⁸ настоящее , это не может быть проверена.

В этом исследовании мы предполагаем, что импедансной спектроскопии может быть полезным инструментом для изучения нескольких типов ионных каналов измеряются одновременно. Хотя метод, представленный никогда не была использована, чтобы выделять течения из двух типов каналов измеряются одновременно, импедансной спектроскопии был использован для исследования и ряд других аспектов функции ионного канала. Гудман и искусства показали использовании черепахи слуховые волосковые клетки, что нынешние протоколы зажим может быть изменен, чтобы настроить ячейку на разные частоты, и колебания в трансмембранного потенциала связано с взаимодействием между внутренним исправления K ⁺ каналов и Са ^{2 +} канал. ⁹ Хана и Фрейзер показали, что сопротивление может быть измерена в одной ячейке в широком диапазоне частот (100 Гц до 5 МГц), а также увеличение сопротивления наблюдается при K ⁺ или Са ^{2 +} каналы были заблокированы, могут быть простыми средствами обнаружить канал блока в высоких экраны наркотиков пропускную ^10. Хаяси и Фишман использовали комплексной проводимости для изучения кинетических свойств внутреннего исправления K ⁺ канала. ¹¹ Другие группы вставили одной частоты в напряжение протокол зажим различных типов каналов и показали, что наблюдается частотная согласился с ожидаемой реакции на некоторые частоты, но не другие. ^12,13 Millonas и Hanck предложил причине некоторые частоты не дали ожидаемую реакцию, является наличие нескольких констант скоростей в модели Маркова. ¹² Исследования, такие как эти, а также другие, показали, что Есть случаи, когда ионные токи измеряется от ионных каналов при использовании импедансной спектроскопии не согласны с теоретической АЧХ. Это не имеет значения в данном исследовании, потому что цель метода в данном исследовании является определение частот, которые коррелируют с амплитудой тока зависят от исходных предположений мембраны электрической цепи. Furtheremore, амплитуда тока рассчитывается по части записи, которые не имеют никакого шума функции вставляются в них. Ряд других исследований также существующие модели многочисленных ионных каналов выставке многочисленных государств проводить и без проведения всех со своими константами скорости. ^14,15,16 Томпсон и др. показали, что селективность фильтра канала КГГА имеет разные сайты связывания Na ^+, Li + и K ^+, и энергичная расходов на переезд из одного связывающего участка к другому, как ион проходит через избирательность фильтра является то, что делает канал преимущественно поведения ионов К ⁺ через ее поры. ¹⁷ В данной работе мы вставили диапазоне частот (шум функции) в напряжение протокол шаг и посмотрел на частоты, амплитуда которых сильно коррелируют с общей амплитудой тока. Так как сильное доказательство было представлено предлагая несколько констант скоростей играть роль в проводимости ионов через дифференциальноет каналов, внедрение частот, связанных с этими константами скорости может вызвать определенные частоты в резонанс или в значительной степени коррелирует с амплитудой тока, которые не имели бы. Техника показала в этом исследовании проводится на клеточную модель, которая является параллельной RC-цепь, которая обычно используется для проверки напряжения схемы зажим и приобретение оборудования. Не ожидается, что любой, кроме частот DC будет коррелировать с текущей величины, и это показано в наших данных. Также показано, что добавление шума функция не вызывает никаких частот высоко коррелирует с амплитудой тока. Эти два выводы имеют важное значение, потому что они показывают, что измерительное оборудование и шума функции сами по себе не вызывает никаких частот коррелирует с амплитудой тока. При дальнейших исследованиях производить измерения с использованием мембран содержащих ионные каналы, ожидается, что в зависимости от используемого канала, частоты, соответствующие константы скорости в фильтре избирательность или, возможно, пора будет влиять на частотную характеристику канала и повлиять на какие частоты имеют высокую или низкой корреляции с амплитудой тока.

Поскольку этот метод является новой техники для изучения ионных каналов, Есть ряд направлений будущих исследований могли бы следовать. Во-первых, техника должна быть использована для характеристики частотной характеристики конкретных изолированных каналов. Дополнительная работа также должна быть сделана для калибровки частоты амплитуды к текущей амплитуды. После нескольких каналов характеризуются индивидуально, несколько типов канал должен быть измерены одновременно. Метод может быть также адаптирован для использования в потенциал действия зажим, токовые клещи, и полевые исследования стимуляции. Хотя это и новая техника, это показывает, что может быть мощным способом сделать электрофизиологических измерений, которые ранее были невозможны и дать ценную-новому взглянуть на физиологической роли ионных каналов.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Matlab		Mathworks	n/a	Natick, MA
Clampex 8		Molecular Devices	Clampex 8	Sunnyvale, CA
Integrating Patch Clamp Amplifier		Molecular Devices	Axopatch 200	Sunnyvale, CA
Headstage		Molecular Devices	CV202	Sunnyvale, CA
16-Bit Data Acquisition System		Molecular Devices	Digidata 1322A	Sunnyvale, CA
Model Cell		Molecular Devices	Patch 1 Model Cell	Sunnyvale, CA