Microscale 열 대류를 사용하여 신속한 PCR의 Thermocycling

Summary

우리는 효소의 연쇄 반응 (PCR)을 통해 DNA의 복제를 수행하는 소설 방법을 설명합니다. 열 대류는 일정한 온도에서 반응기의 표면에 반대 유지하여 denaturing 소둔 및 확장 조건 사이의 지속적인 셔틀 시약을 무력화합니다. 이것은 본질적으로 단순한 디자인은 신속한 PCR 더 접근할 수 있도록 약속드립니다.

Abstract

많은 분자 생물학의 assays가 감지 농도 수준에 초기 희석 대상의 DNA 샘플을 증폭하는 효소의 연쇄 반응 (PCR)에 어떤 식으로든 따라 달라집니다. 그러나 기존의 PCR의 thermocycling 하드웨어의 설계는 주로 그의 온도 열전 히터에 의해 규제되어 심각하게 달성 반응 속도 ¹ 제한 대규모 금속 가열 블록을 기반으로. 상당한 전력 또한 휴대용 형식으로이 악기를 배포할 수있는 능력을 제한, 반복 열 및 시약 혼합물을 냉각이 필요합니다.

열 대류는 이러한 ^한계를 극복에게 ^2-9으로 잠재력을 가진 유망 대체 thermocycling 접근 방식으로 부상했다. 대류 흐름은 장식과 다채로운 용암 램프에 지구의 대기, 바다, 인테리어,에 이르기까지 설정의 다양한 배열에서 매일 발생하고 있습니다. 유체 운동은 각각의 경우에 같은 방법으로 시작됩니다 부력 중심 불안정 액체가 국한 볼륨 공간의 온도 기울기의 대상이되었을 때 발생합니다. 이 같은 현상은 PCR의 thermocycling을 수행하는 매력적인 방법을 제공합니다. 적절하게 설계된 원자로 기하학에 걸쳐 정적 온도 기울기를 적용함으로써, 지속적인 순환 흐름이 반복, denaturing 어닐링과 반응 (그림 1)의 확장 단계와 관련된 온도 영역을 통해 PCR 시약의 수송을 것입니다 설정할 수 있습니다. Thermocycling 따라서 완전히 반복 열 및 악기를 냉각하지 않아도, 간단하게 고정 온도에서 두 대립 표면을 개최하여 의사 등온 방식으로 actuated 수 있습니다.

대류 thermocyclers의 디자인을 직면하고있는 주요 과제 중 하나는 정확하게 시약은 순차적으로 시간 ^10,11의 충분한 기간 동안 정확한 온도 영역을 차지할 수 있도록 원자로 내의 공간 속도 및 온도 배포판을 제어하기 위해 필요합니다. 여기 microscale 대류 thermocyclers ¹² 전체 3 – D 속도 및 온도 배포판을 탐사하기위한 노력의 결과를 설명합니다. 예기치 않게, 우리는 시약 최적의 온도 프로파일의 전체 범위를 샘플 수있는 향상된 기회를 제공하는 흐름 경로 사이에 (1) 지속적인 교류의 시너지 조합에 의한 PCR을위한 매우 유리한 아르 복잡한 유동 궤도의 하위 집합을 발견하고, (이 2) 증가 시간은 PCR의 단계를 제한 확장 온도 영역 내에서 속도를 보냈다. 매우 빠른 DNA를 증폭 시간 (10 분 이하) 이러한 흐름을 생성하기위한 원자로에서 달성하고 있습니다.

Protocol

1. 대류 Thermocycler의 기본 설계 우리는 누구의 온도 독립적으로 (그림 2) 7 제어 두 알루미늄 플레이트 사이에 끼워 넣으면 아르 호환 플라스틱 반응 챔버 "카트리지"로 구성된 간단한 대류 thermocycling 장치를 건설했습니다. 원통형 반응기 우물은 구멍 직경하고 원하는 가로 세로 비율 (높이 / 지름 = H / D) 달성을 채용 플라스틱 시트 두께의 다른 조합과 폴리 카보 네이트 블록의 구멍 가공 배열에 의해 포함됩니다. 두 가지 다른 원자로 형상은 여기 제시 결과에 간주됩니다 : H / D = 9 : H = 15.9 mm, D = 1.75 mm, 38.2 μL 볼륨, H / D = 3 : H = 6.02 mm, D = 1.98 mm, 18.5 μL 볼륨. 반응기의 바닥 표면은 microprocesser 구동 온도 컨트롤러와 인터페이스 카트리지 히터를 포함하는 알루미늄 블록을 사용하여 가열합니다. 반응기의 상단 표면에 온도는 순환 물을 욕조에 연결된 알루미늄 블록을 사용하는 규제이다. 온 회중은 반대 알루미늄 블록 사이의 열전도를 제한하는 나일론 나사를 사용하여 서로 고정되어있다. 2. 준비 및 PCR 반응 혼합물의 로딩 전형적인 100 μL 반응 혼합물은 10X 버퍼 용액, 25 MM 6 μL의 10 μL를 포함 MgCl 2, dNTPs 10 μL (2 MM 각), DI 물, β – 굴지 프로브 10 μL, β 10 μL의 41.2 μL – 굴지 앞으로의 뇌관, β – 굴지의 역방향 프라이머 10 μL, 인간 게놈 DNA 템플릿 (10 NG / μL) 2 μL 및 KOD DNA의 효소 (2.5 단위 / μL)의 0.8 μL. 시약을 로딩하기 전에, 알루미늄 테이프 얇은 시트를 사용하여 PCR 챔버의 바닥 표면을 밀봉. 비 – X 안티 – 안개 뒤에 소 혈청 알부민의 10 MG / ML 수용액으로 원자로 우물 린스. 피펫 긴 젤 – 로딩 피펫 팁을 사용하여 반응기 우물에 시약 및 FEP 테플론 테이프 상부 표면을 밀봉. 3. 대류 Thermocycler의 반응을 실행 원하는 위턱과 아래턱에 표면 온도에 대한 반응, 앞서 열을 가하다 알루미늄 블록을 모두 시작하기 전에. 샌드위치는 플라스틱 원자로는 알루미늄 가열 블록 사이의 PCR 시약과 함께로드하고, 신속하게 나일론 나사를 사용하여 함께 어셈블​​리를 클램프. 반응이 원하는 시간에 진행 후 히터를 끄고 급속하게 그것을 냉각하고 대류 흐름을 막을 차게 금속 블록의 상단에있는 장치의 낮은 (뜨거운) 표면을 놓으십시오. 플라스틱 원자로를 제거하고 후속 분석을 위해 우물 (긴 겔 로딩 도움말을 사용)의 제품을 피펫. 4. 젤 전기 영동 분석을 수행 솔루션은 분명해진다 때까지 감동 뜨거운 접시에 1X 버퍼 500 ML와 아가로 오스의 10g을 가열하여 2 % 아가로 오스 겔 WT를 준비합니다. 캐스팅 트레이에 아가로 오스 겔을로드하고 빗를 삽입합니다. ~ 30 분 젤 세트를 보자. 빗를 제거하고 젤이 변할 때까지 1X 태 버퍼를 추가합니다. 찬란 스테인드 DNA 샘플 2 μL 100x SYBR 그린 I 솔루션, 2 μL DNA 샘플, 2 μL 배의 오렌지 로딩 염료, 4 μL 태 버퍼가 포함되어 있습니다. 우물에 DNA 샘플을 추가하고 100 BP의 DNA 사다리 사이징 마커 1 H 60 V의 분리를 실행합니다. 젤을 제거하고 결과를 얻기 위해 자외선 밑에 사진. 5. 대표 결과 : 대류 thermocyclers의 최적 설계 PCR 과정에 참여의 핵심 온도를 통해 시약을 수송 수있는 순환 흐름을 생성합니다 올바른 원자로 지오메 트리를 선택 포함됩니다. 여기에 고려 원통형 원자로에서 변경될 수있는 기하학적 매개 변수는 높이 (H)와 직경 (D), 또는 equivalently 비율 (H / D)입니다. 우리는 내부 전산 유체 역학 (CFD)을 사용하여 서로 다른 가로 세로 비율의 범위에서 PCR 반응 대류 3 – D 흐름 필드를 탐험하고, 예기치 않게 복잡한 패턴이 발생할 수 것으로 나타났습니다. 더 중요한 건, 우리의 분석은 크게 반응 12 가속 이러한 복잡한 유동 분야의 일부를 발견했습니다. 이러한 기하학적인 효과는 분명하게 높고 낮은 가로 세로 비율에서 반응기의 흐름 필드를 비교하여 볼 수 있습니다. 높은 비율의 경우에는 (H / D = 9; 키, 마른 체형의 실린더), 유체 요소는 기본적으로 루프를 폐쇄 경로를 추적 궤도를 따라 advected 있으며, 그들은 오랜 기간 동안 동일한 경로를 따라 잠겨있다 시간 (그림 3A). 따라서, F 사이의 교환을위한 약간의 기회가 있습니다PCR (어닐링과 반응의 상단 및 하단 표면에 극단을 denaturing 사이 진동)과 (중앙에 가까이화된 증폭에 기여하지 남은 궤도의 훨씬 더 큰 앙상블을위한 온도 조건을 최적의 순서에 시약을 노출 낮은 궤도 원자로의). 유체 요소의 탄도는 더 이상 닫힌 경로 (그림 3B)을 따라 그 의미에 더 혼란되고; 흐름 필드는 작은 비율 (짧고, 넓은 실린더 H / D = 3)에서 많은 차이가 있습니다. 따라서 시약은 더 복잡한 온도 프로파일의 대상에도 불구하고, 유체 요소는 시약 볼륨의 이상이 최적의 온도 프로파일을 경험할 수있는 기회를 가지고 있도록 궤도의 훨씬 넓은 범위를 탐험하실 수 있습니다. 이러한 결과는 counterintuitively H / D에서 동시에 각각의 흐름 궤도가 = 9 온도 프로파일을 제작하여 PCR에 대한 더 유리한 것으로 나타날 수 있습니다하는 것이 좋습니다되는 종래의 thermocycler / H에서 유동 분야의 혼란 자연 속에서 고용 비슷한 "모양" D = 3 궁극적으로 시약이 매우 오래 불리 궤도에 갇혀있다가하지 않도록 강화된 교류를 촉진하여 세계적인 규모로 역할을 하죠. 이 가설을 테스트하고 원자로 기하학은 PCR에 대한 더 유리한되었던 확인하려면, 우리는 인간 게놈의 DNA 템플릿에서 β – 굴지의 유전자와 관련된 295 BP 대상의 PCR 복제를 수행하는 둘 다를 사용합니다. 현저하게, 우리는 정기적으로 H에서만 10 분에 올바른 대상 제품의 증폭을 달성 / D 감지 제품 전에 최소한 20 분 필요 같은 반응은 H / D에서 관찰하는 동안 = 3 (그림 4A) = 9 (그림 4B) . 반응 특이성도 H에 훨씬 큰 / D = 3 어디서 여러 특이 현상이 제품은 H에 생성되는 동안 단일 PCR 제품이, 얻은 것입니다 / D = 9 어디 흐름 필드 트랩 오랜 기간 동안 불리한 열됐던 유체 요소. 그림 1. 상단 및 하단 표면 원통형 챔버에서 열 대류는 다른 고정 온도에서 유지됩니다. 바닥 표면의 온도가 상단에보다 높은 경우, 수직 밀도 기울기는 순환 흐름 패턴을 생성할 수있는 동봉된 유체 내에 설립. 기하학적 매개 변수 (높이 H와 직경 D)의 올바른 선택을 통해 대류 흐름 필드가 위쪽과 아래쪽 표면이 각각 온도 (중력이 수직 하향 행위) 소둔 및 denaturing 근처 manintained 때 PCR의 thermocycling을 행동시키다을 무력화 수 있습니다. 그림 2. (A) 대류 흐름의 주요 구성 요소가 PCR thermocyler. 원자로 카트리지는 원통형 챔버의 배열을 포함하는 폴리 카보 네이트 블록으로 구성되어 있습니다. 블록 순환 물 목욕 및 임베디드 히터를 통합 하단 플레이트에 연결하도록 설계된 최고의 접시 사이에 끼워 넣으면됩니다. (B) PCR의 시약은 장치가 반응을 수행하기 위해 조립하는 후, 로드된 및 원자로 카트리지 내부에 봉인하고 있습니다. 완료되면, procucts 쉽게 후속 분석을 위해 밖으로 pipetted 수 있습니다. 그림 3. 53과 96 온도와 원통형 반응기 내부에 생성되는 3 – D 대류 유동 분야의 전산 시뮬레이션 ° C 각각의 상단 및 하단 표면에 내려졌다. 결과의 가로 세로 비율에 표시됩니다 (A) H / D = 9 (38.2 μL 원자로 볼륨) 및 (b) H / D = 3 (18.5 μL 원자로 볼륨). 3D 흐름 필드를 통해 여행 유체 요소로 다음 대표 궤도가에 표시되는 경로의 – 상단과 측면보기 예측과 함께 왼쪽, 유체 요소에 다음과 같은 온도 대 시간의 해당 플롯은 오른쪽에 표시됩니다. H / D = 9시 온도 프로파일은 종래의 thermocycler의 가까이에 나타나지만, H / D = 3에서 혼돈 흐름 필드는 PCR에 대한 counterintuitively 더 유리한 것입니다. 그림 4. DNA 복제 그림 3 (표면이 각각 53과 96 ° C로 유지되었다 상단과 하단)에 표시된 반응기 형상에서 얻어진 결과를. (A) PCR은 크게 반응 시간을 불과 10 분 (: 100 BP의 사다리, 차선 1-4 : 4 개의 원통형 실에서 병렬 반응의 제품 M) 이후에 보이는 강한 제품으로 분명, H / D = 3 가속됩니다. (B </str긴 사연이>) (M 보이는 제품이 관찰되기 전에 H / D = 9시 공연 같은 반응은 적어도 20 분이되어 있어야하고, 여러 밴드가 원하는 제품 이외에 불특정 대상의 DNA 명백히 나타내는 복제 아르 : 100 BP 사다리, 레인스 1-2 : 2 다른 원통형 실에서 병렬 반응의 제품).

Discussion

유동 및 화학 반응 사이의 상호 작용은 혼란 advection의 영향에 따라 크게 변경할 수 있습니다. 그러나 이러한 복잡한 흐름 상태는 특히 3D 효과가 중요 해지고 현실적인 형상에서 공부를 도전하고 있습니다. H에서 레일리 – 버나드의 대류 / D> 1뿐만 아니라 이러한 현상을 탐험하는 편리한 플랫폼을 제공, PCR을 수행하기 위해 응용 프로그램은 또한 탐지하는 흐름과 화학 반응 사이의 커플링을 수 있습니다. 이 독특한 기능은 가능한 혼란 효과 행위 (counterintuitively) DNA 복제의 속도를 가속하기 위해 최적의 흐름 상태를 선택할 수 있습니다.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
KOD DNA Polymerase kit		Novagen	71085-3
TaqMan β-actin Control Reagents kit		Applied Biosystems	401846
Aluminum tape		Axygen, Inc.	PCR-AS-200
Bovine serum albumin		Sigma-Aldrich	A2153
Rain-X Anti-Fog		SOPUS Products
Long Gel-loading Pipette Tips		Fisher Scientific	05-408-151
FEP Teflon tape		McMaster-Carr	7562A17
Agarose gel		Bio-Rad	161-3107
TAE running buffer		Bio-Rad	141-0743
SYBR Green I		Invitrogen/Molecular Probes	S7563
6x Orange Loading Dye		Fermentas	R0631
100 bp DNA ladder sizing marker		Bio-Rad	170-8202