Este protocolo descreve os passos necessários para dissecar, transfectar via de eletroporação e neurônios do hipocampo e da cultura do mouse cortical. Curto prazo, as culturas podem ser utilizados para estudos sobre crescimento do axônio e orientação, enquanto culturas a longo prazo podem ser usados para estudos de sinaptogênese e análise espinha dendrítica.
Neurônios do hipocampo e cortical tem sido amplamente utilizado para o estudo do sistema nervoso central (SNC) de polarização neuronal, axônio / dendrite conseqüência, e formação de sinapses e função. Uma vantagem do cultivo desses neurônios é que eles prontamente polarizar, formando axônios e dendritos distintivo, sobre um substrato bidimensional em densidades muito baixas. Esta propriedade tornou-os extremamente útil para determinar muitos aspectos do desenvolvimento neuronal. Além disso, através do fornecimento condicionado glial para estes neurônios que continuará a desenvolver, formando conexões sinápticas funcionais e sobreviver por vários meses em cultura. Neste protocolo, esboçamos uma técnica para dissecar, cultura e transfectar neurônios do hipocampo e embrionárias de camundongos cortical. Transfecção é realizado por electroporating DNA nos neurônios antes do plaqueamento via nucleofection. Este protocolo tem a vantagem de expressar proteínas de fusão fluorescente-tag no início do desenvolvimento (~ 4-8hrs após o plaqueamento) para estudar a dinâmica e função de proteínas durante a polarização conseqüência axônio, e de ramificação. Também descobrimos que este transfecção único antes do plaqueamento mantém a expressão da proteína fluorescente-tag de fusão em níveis adequados para a imagem latente durante toda a vida do neurônio (> 2 meses em cultura). Assim, esta metodologia é útil para estudar a localização de proteínas e função ao longo do desenvolvimento do SNC, com pouca ou nenhuma perturbação da função neuronal.
Este protocolo para cultivo embrionário neurônios do hipocampo do rato e cortical foi desenvolvido como uma modificação do protocolo de Banker, que usa 1,2 neurônios de rato. Nós temos usado esse protocolo para mouse cultura e neurônios hamster bem 3,4,5,6,7. Este protocolo funciona igualmente bem para ambos os neurônios do hipocampo e neocortical e é semelhante a um protocolo publicado pela Meberg e Miller 8. Geralmente, nós usamos os neurônios do hipocampo para o longo prazo de cultura, porque eles estão bem caracterizadas e um sistema modelo mais estabelecida. Além disso, são susceptíveis de conter uma população mais homogênea de neurônios do neocórtex. No entanto, os neurônios neocorticais cultivadas usando este protocolo também sobrevivem e se diferenciam de forma semelhante (dados não publicados). Nós usam rotineiramente os neurônios do hipocampo e neocortical para a cultura de curto prazo. Dissecção do neocórtex também resulta em neurônios substancialmente mais (1.5×10 6 neurônios por par de córtices) do que a dissecação do hipocampo (2.5×10 5 neurônios por par de hipocampo), o que torna uma melhor escolha do material para secar Ocidental, por exemplo.
Como acontece com qualquer cultura primária, é essencial para minimizar o tempo que leva desde a morte do animal para o revestimento das células. Ele geralmente leva 10-20 dissecções para se tornar consistentemente rápido em dissecção e revestimento. Além disso, ao trabalhar com o Nucleofector Lonza, é fundamental para trabalhar com rapidez durante o processo de eletroporação, como a viabilidade dos neurônios diminui rapidamente se forem deixados no buffer nucleofection.
Grande parte da nossa imagem é realizado com microscopia de fluorescência interna reflectância total (TIRFM). Este tipo de microscopia só é capaz de imagem várias centenas de nanômetros além da lamela. Portanto, as áreas dos neurônios que freqüentemente imagem, o cone de crescimento axonal e espinhas dendríticas, devem ser respeitados diretamente para a lamela. Assim, usamos as culturas de baixa densidade que exigem alimentação glial de longo prazo de cultura. Temos usado as culturas de maior densidade (> 2×10 4 células / cm 2), sem camadas de alimentação glial, a longo prazo culturas e descobriram que eles sobrevivem muito bem com a alimentação pouco. No entanto, as espinhas dendríticas desses neurônios são muitas vezes muito longe do substrato para a imagem em TIRFM, embora possam ser facilmente detectados com ampla microscopia de campo ou microscopia confocal.
Na maioria dos nossos estudos, transfectar neurônios antes do plaqueamento, e ter imaginado proteínas fluorescentes marcado por até três meses em cultura. Esta expressão de longo prazo de proteínas fluorescentes marcado nos dá confiança de que, ao utilizar baixas concentrações de DNA (1-2μg) que não estão produzindo artefatos superexpressão nos neurônios. No entanto, este procedimento também pode ser usado para estudar a superexpressão de proteínas se grandes quantidades de DNA são utilizadas (10-20μg). Os plasmídeos que usamos para transfecção neurônios geralmente contêm proteínas de fusão EGFP ou mCherry, embora também rótulo do citoplasma neuronal com DsRed2 ou EGFP sozinho. Esta técnica funciona bem eletroporação com um número de vetores. Nós preferimos plasmídeos que contêm um promotor de β-actina com um enhancer CMV e β-globina cauda poli-A (pCAGGs ou pCAX plasmídeos) 9, devido aos níveis relativamente altos de expressão, eo fato de que eles são bem tolerados pelos neurônios tanto na cultura de curto e longo prazo. Geralmente, as proteínas começam a se expressar dentro de cerca de 4 horas de revestimento e alcançar níveis suficientes para a imagem latente dentro de 10-24hs 10. Temos utilizado com sucesso CMV-promotor-driven plasmídeos em curto prazo culturas, mas descobriram que eles podem causar altos níveis de superexpressão que matam neurônios em longo prazo de cultura. No entanto, temos verificado que o condicionamento glial de culturas de baixa densidade ajuda na sobrevivência de neurônios transfectadas com CMV-promotor plasmídeos impulsionado, em comparação com maior densidade (não-glial alimentados) culturas.
The authors have nothing to disclose.
Todos os procedimentos foram aprovados pela Universidade de Wisconsin Comissão do Animal Care e estavam em acordo com as diretrizes do NIH. Agradecemos ao Dr. Katherine Kalil para o uso generoso do seu dispositivo Nucleofector. Agradecemos também aos membros do laboratório de Dent para comentários sobre o protocolo. Este trabalho foi suportado por concessões do NIH R01-NS064014, Dana Foundation e Fundação para Whitehall EWD
Christopher Viesselmann, Jason Ballweg e Derek Lumbard contribuíram igualmente para este papel.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Sodium Borate | Fisher | S93356 | Store borate buffer at room temperature (RT). | |
Poly-d-Lysine | Sigma | P7886-100mg | Dissolve in 0.1M borate buffer. Sterile filter and store aliquots at -80°C. | |
Trypsin (10x) | Invitrogen | 15090-046 | Store aliquots at -80°C. | |
DNase (10x) | Sigma | DN25-1G | Store aliquots at -80°C. | |
MEM | Invitrogen | 11095-080 | Store at 4°C. | |
HBSS (10x) | Invitrogen | 14185-052 | Store at RT. | |
HEPES (100x) | Invitrogen | 15630-080 | Store at 4°C. | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Invitrogen | 15140-122 | Store aliquots at -80°C. | |
Horse Serum | Hyclone | SH3007403 | Store aliquots at -80°C. | |
Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25200-056 | Store at 4°C. | |
Neurobasal E (NB) | Invitrogen | 21103-049 | Store at 4°C. | |
B27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | Store aliquots at -80°C. | |
Glutamine (100x) | Invitrogen | 25030-081 | Store aliquots at -80°C | |
30% Glucose in NB (100X) | Fisher/Invitrogen | BP350-500 | Dissolve glucose in NB and sterile filter. Store at 4°C. | |
3.75M NaCl in NB (100X) | Fisher/Invitrogen | BP358-1 | Dissolve NaCl in NB and sterile filter. Store at 4°C. | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH3007003 | Store aliquots at -80°C. | |
Paraffin/Petroleum Jelly (3:1 w/w) | Fisher | Paraffin – P31-500 Petroleum – P66-1 | Combine in conical tube and melt in boiling water. | |
Concentrated Nitric Acid (HNO3) | Fisher | A509-212 | Store at room temperature. Can be reused several times. Discard if it yellows. | |
5mM cytosine –B-D-arabinofuranoside hydrochoride (AraC) in NB (1000X) | Sigma | C6645 | Dissolve AraC in NB and sterile filter. Store at -80°C |
*Most reagents that we store at -80°C can be stored at -20°C as well. Storing them at -80°C lengthens their shelf life and results in slightly more consistent cultures.