不结盟纤维直接的神经元在体外的生长,是一个潜在的神经再生的支架组成部分。我们描述了一个准备静电纤维基材和主大鼠E15感觉(DRG)和运动神经元无血清培养的过程。用免疫细胞化学神经元的可视化也包括在内。
静电是微纳米尺度的纤维生产的技术。纤维可与不同高度完全是随机的对齐,对齐度,静电。此外,纤维可纺的各种材料,包括可生物降解的聚合物,如聚- L -乳酸(PLLA)。这些特点使电纺纤维适合在组织工程中的各种脚手架应用。我们的重点是使用对齐神经再生的电纺纤维。我们曾表明,对齐静电聚乳酸纤维直接的初级感觉和运动神经元在体外的生长。我们维持生物材料尽可能接近体内发现真正的神经元模型进行评估时,一个主要的细胞培养系统的使用是必不可少的的。在这里,我们描述了在我们的实验室中使用electrospin纤维支架和文化背根神经节外植体,以及分离的感觉和运动神经元上的静电支架,技术。然而,静电和/或很容易适应这里介绍的养殖技术在其他应用程序使用。
该协议有几个关键步骤。首先涉及到电纺纤维基板的正常生产。在液体介质中,聚乳酸纤维的PLGA膜和PLGA护城河将单独作为一个单元的玻璃盖玻片。如果省略的PLGA,聚乳酸纤维不会仍然是一个平板 – 他们会卷曲成一个不可用的纠结。因此,PLGA的电影是一个合适的基板文化的过程中保持光纤对准。护城河是添加后纺,以确保纤维的PLGA薄膜牢固地固定和增加结构刚性的电影。护城河也是当基板固定,染色和安装过程中操纵,作为一个有用的处理。 Trituration是第二个关键步骤。应该尽一切努力,以避免形成泡沫。此外,我们已经取得的收益要高得多时,火抛光的吸管是这一步。要火波兰,点燃本生灯和吸管连接一个灯泡。通过吸管尖迅速通过火焰2-3次,同时不断挤压和释放灯泡 – 空气流通过吸管将有助于防止从完全关闭提示。检查吸管尖,以确保孔仍处于打开状态,使用前圆润的边缘出现轻微。
静电是一个非常灵活的过程;电参数进行修改,以产生的各种形态的纤维。 Tan 等 (2005)详细介绍了影响聚乳酸纤维的直径参数的系统研究。王等人 (2009)提出了影响静电纺丝聚乳酸纤维的对齐参数的详细研究。
The authors have nothing to disclose.
美国国立卫生研究院K08 EB003996
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
PLLA | Boehringer Ingelheim | Resomer L210 | ||
PLGA 85:15 | Sigma | 43471 | ||
L15 | Gibco | 11415 | ||
Albumin | Sigma | A2289 | ||
Apo-transferrin | Akron | AK8227 | ||
Biotin | Fisher | AC 23009-0010 | ||
Galactose | Sigma | G0625 | ||
Progesterone | Sigma | P7556 | ||
Putrescine | Sigma | P5780 | ||
Selenium | Sigma | S9133 | ||
β-estradiol | Sigma | E 1132 | ||
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | ||
Catalase | Sigma | C40 | ||
Superoxide dismutase | Sigma | S4636 | ||
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | ||
PSN | Gibco | 15640 | ||
L-glutamine | Nalgene | 1680149 | ||
Trypsin | Nalgene | 1689149 | ||
Fetal bovine serum | Gibco | 26140 | ||
Optiprep | Accurate | 2011 | ||
PLL | Sigma | P4832 | ||
Fibronectin | Sigma | F 4759 | ||
Laminin | Invitrogen | 23017-015 | ||
B27 | Gibco | 17504-044 | ||
BSA | Sigma | A7906 | ||
Anti-TuJ1 | BD Biosciences | 556321 | ||
Anti-neurofilament | Millipore | AB1987 | ||
Anti-S100 | Sigma | S2532 | ||
Anti-NGFR p75 | Sigma | N3908 | ||
Normal goat serum | Sigma | G6767 | ||
Triton X-100 | Sigma | T9284 | ||
Sodium azide | Sigma | S8032 | ||
Carbon tape | Ted Pella | 13073-1 | ||
Prolong Gold +DAPI | Invitrogen | P36931 |