从巨纤维通路的电生理记录 D。果蝇</em
Summary
巨人的光纤系统是一个简单的成人神经电路<em>果蝇</em>包含在飞最大的神经元。我们描述了通过这一途径，通过记录背侧纵器（DLM）和tergotrochanteral（TTM）肌肉巨人光纤interneurons直接刺激后突触电位监测突触传递的协议。
Abstract
当一震成人D 。 果蝇的反应，跳跃到空中飞走。在许多无脊椎动物，包括D。果蝇 ，“越狱”（或“不惊人死不休”）在成年阶段的反应是介导的多组分的神经电路，称为巨型纤维系统（ GFS）。比较大尺寸的神经元，其独特的形态，简单地连接，使政府飞行服务队有吸引力的模型系统，为研究神经回路。政府飞行服务队的途径是由两个双边对称的巨型纤维（GF）interneurons，其轴突从大脑通过宫颈结缔组织胸神经节沿中线下降。腹侧神经节政府飞行服务队的形式电化学突触1）内侧的大枝晶的同侧motorneuron（TTMn）驱动tergotrochanteral肌肉（TTM），主要mesothoracic股骨/腿伸在mesothoracic neuromere（T2） 2）对侧外周突触中间神经（PSI），反过来形式背纵肌（DLMS）motorneurons（DLMns），机翼depressors突触化学（胆碱）。神经通路（S）（DVMs）dorsovental肌肉，翼电梯，尚未制定出（DLMS和DVMs共同被称为间接飞行肌 – 他们不直接连接的翅膀，而是移动翅膀间接地扭曲了附近的胸角质层）（国王和黄伟文，1980年，艾伦等人，2006年） 。的DLMS DI -突触激活（通过PSI），导致在这些肌肉的收缩，相对的TTM突触激活（0.5毫秒），让TTMS首先向股骨和推动时间的小而重要的延迟飞了地面。该TTMS同时舒展激活DLMS这反过来又相互牵拉激活飞行时间DVMs。的GF途径可以被激活或者间接地运用感官（如“空调卖自夸”或“灯关闭”）的刺激，或直接由一个超阈值电刺激大脑（详见这里）。在这两种情况下，动作电位达到仅通过政府飞行服务队，PSIS，TTM / DLM的运动神经元的TTMS和DLMS，TTMns和DLMns虽然也有其他的，身份不明的，感觉输入。测量“延迟反应”（之间的刺激和肌肉去极化时）和“下面的高频刺激”（成功应对一定数量的高频刺激）提供了一种方法，重复性和定量评估的功能状态政府飞行服务队的组成部分，包括中央突触（GF – TTMn，GF – PSI，PSI – DLMn）和化学（谷氨酸）神经肌肉接头（TTMn – TTM DLMn – DLM的）。它已被用于确定中央突触的形成有关的基因，并评估中枢神经系统功能。
Protocol
1。设备和材料这些实验中使用的一个刺激，刺激隔离病房，两个微电极放大器，数据采集系统和采集软件与计算机组成一个标准的电设置。附加设备包括一个法拉第笼，一个蓬勃发展的立场上的体视显微镜，振动隔离表，光源，和录音平台。 五micromanipulators是使用。两个micromanipulators需要记录电极定位的精细控制，而其他三个micromanipulators只需要总值的控制地位的两个刺激电极和接地电极。 DLM的记录电极显微被放置在尾部的准备（实验者左）和显微为TTM记录电极之间的实验者和编制方（略实验者左侧）。两个micromanipulators将举行模拟电极放置在头（右）的实验者的准备。接地电极的显微操纵器是放置在远方的准备 40-60MΩ的电阻上拉玻璃记录微电极，并存储在一盘由蜡的支持单位。刺激，两个电解（氢氧化钠）削尖的钨电极使用。一个钨丝，或第三电极电解编造用作地面。准备的刺激和接地电极和连接到micromanipulators实验会议开始前，不需要在会议期间所取代。 2。准备了D.果蝇 一旦你的设备是成立的，它的时间来准备的苍蝇。冷却冰或使用的CO 2麻醉的苍蝇。如果使用的CO 2，然后让气体的影响有足够的时间（约20分钟），穿脱实验开始前。 使用镊子，转移他们的腿苍蝇，轻轻一盘菜，含有约45 °角倾斜的软蜡平台。接下来的四个步骤完成在解剖显微镜下离（但接近）的录音设备。 下一步是争取在蜡飞。东方飞腹面朝下，与前面临的斜坡上向上。使用一双细镊子，腿向外延伸，对他们推入蜡。 熟悉自己的肌肉的位置，记录：背纵肌，或DLM的，和tergotrochanteral肌肉，或TTM。符合地区之间的胸廓中线和前背鬃（或刚毛）的DLMS subcuticular附着点。 TTM附着点是位于背部的后部和前超鼻翼刷毛。确保的翅膀会不会阻碍访问的DLM或TTM纤维，举行的翅膀向外，“胶水”蜡。 使用产钳的罚款对拉长鼻向外仔细，并确保它浸入蜡。这是关键的一步，需要一定的练习，因为长鼻是软的，很容易从头部的其余部分分离。如果出现这种情况，弃飞，并重新开始。通过眼睛的刺激电极插入时，以这种方式来保护头部的失败导致问题。 3。放置电极一旦飞是固定的蜡，转让的体视显微镜，这是位于内的法拉第笼底的附加飞盘。东方飞侧身实验者的权利飞头。 接下来的步骤是插入电极。不通过显微镜，可以插入地面和刺激电极。良好的录音依靠精确的刺穿，因此，它是一个好主意实践处理micromanipulators。把电极接近插入部位micromanipulators的帮助，以促进其应有的配售及后续的录音。 下进入调整车轮上使用的显微腹部的后部的接地电极。要削尖钨刺激电极放置在大脑中，使用的显微一个电极尖端的位置，所以它只是涉及苍蝇的眼睛。与其他同时使两个电极刚刚接触外面的每只眼睛。然后推电极，反过来，通过每只眼睛，使电极的技巧达到在头舱背（约2 – 3mm）位于大脑。 正确放置电极，将激活巨大的光纤系统。为了测试，刺激电极放置正确，适用于短（0.03毫秒30-60跨刺激电极V）的刺激，看运动的翅膀和飞行/腿部肌肉抽搐“ 下一步是到后台填写与3M KCl的玻璃微电极，使用汉密尔顿或热拉的塑料注射器，并放入他们的优良控制micromanipulators。正确插入微电极，可用于几轮的实验。 第一个记录电极将被插入到一个DLM的纤维。有两个双边对称DLMS;每一个六个人的肌纤维组成。录音，可从任何六个纤维做;然而，最常用的DLM纤维45A和45B，由于其良好的可通过胸角质层背侧，两种纤维是由同一motorneuron神经支配的事实。 你从最远的一侧使用的显微操纵器，记录电极插入DLM纤维45A或B该平台的斜坡允许DLM的电极进入一个〜60-90 °角，其中艾滋病渗透背角质层。在示波器模式下使用的软件和电脑显示器的外观，同时记录电极插入胸部。当电极已进入肌肉的基线将下降到接近零或为负值。一个单一的刺激，看看您是否可以观察到肌肉反应测试。 其他记录电极插入到离您最近的TTM。这种电极是横向插入，在你面前，由于肌肉附着部位的位置。同时做一个单一的刺激和测试一次跟踪指示电极是在肌肉，再次观察显示器。 4。刺激和记录您现在准备开始从腿部和飞行的肌肉，刺激大脑和记录反应。适用于整个一个短期的刺激（0.03毫秒）在30 V开始增加至60 V，直到你看到一个响应（即肌肉抽搐，肌肉细胞的去极化，在计算机显示器上观察到）的刺激电极。对于实验的其余部分，设置的响应阈值以上的电压5-10 V。 为了测量响应延迟，给予至少5单刺激5每个刺激之间的第二个休息时间。 确定“以下的频率”通过提供不同的利率刺激列车。 10 10刺激的列车通常都在100Hz（10ms的每个刺激之间），200Hz的（每个刺激之间的毫秒）和300Hz的（3ms的每个刺激之间）。允许一个2秒的休息时间，彼此之间的刺激列车。 5。结果：巨人纤维通路的响应延迟和频率响应延迟是刺激大脑和肌肉去极化之间的时间。这个数字比较DLM和TTM的响应延迟到一个单一的刺激。在0.7和1.2 GF – TTM途径和1.3和1.7毫秒之间的MS GF – DLM的途径之间的延迟显示一个健康的准备和正确的记录技术。可以随基因型，遗传背景，温度和年龄的延迟。 图1（A和B）。代表的痕迹，显示了从单一刺激大脑的TTMS和DLMS记录的反应。 如上所示，录制的，TTM相比，那些从大的DLM纤维性突触后电位（PSP）的幅度和形状的多变性，这种增加的可变性是由于小尺寸的TTM肌纤维。然而，这种可变性，不影响巨人光纤到TTM途径的响应延迟值。 图1（C和D）。进一步的反应延迟“的痕迹，为TTM和DLM从4个人的苍蝇。请注意，TTM在PSP形状的痕迹表现出变异，但反应潜伏期不受影响。对于DLM的是PSP的形状变化较少。 比较在100赫兹，200赫兹和300赫兹以下的频率计算成功的反应（满分10分）的比例为DLM和刺激频率在每个TTM途径“”。在100赫兹，TTM和DLM都遵循1:1的刺激。刺激频率在100赫兹以上，DLM的反应开始出现的失败，因为两个interneurons之间的中介，化学突触没有足够的时间恢复之间的刺激。 TTM反应，但是，仍然1:1甚至超出了300Hz的刺激。 图2代表的痕迹，显示“以下的频率”录音。在100Hz，TTMS和DLMS应对所有10个刺激（左）。在200Hz，DLM的反应启动失败（星号）。 6。代表性的成果野生型短潜伏期反应（刺激电极放置在眼睛上，绕过感受器，并直接引发了GF电路）在0.7和1.2 MS GF – TTM途径和之间，取决于基因型，遗传背景，温度和年龄，和范围1.3 and1.7毫秒为GF – DLM的途径（Tanouye和纬，1980年，托马斯和纬，1984;恩格尔和吴，1992年，艾伦和墨菲，2007年，费伦等，2008;。奥古斯丁等人 ，未发表。） 。这很短的TTM延迟是由于强劲的GF – TTMn电化学突触的突触途径和DLM的潜伏期更长的发生，因为disynaptic性质的途径，以及存在一个化学突触（PSI – DLMn）。中程和长潜伏期反应（> 3毫秒）的GF传入激活和使用低强度的刺激，或提供了一个可视化的信号（“轻客”）取得的结果。在100Hz TTM和DLM都应该遵循的刺激1:1。 100Hz以上DLM的反应将开始出现故障，化学突触之间的PSI和DLMns没有足够的恢复时间小于10ms的除了之间的刺激。 TTM反应，但是，将保持甚至超越了300Hz的刺激（Tanouye和黄伟文，1980年恩格尔和吴，1992; Allen 等，2007; Martinez 等人 ，2007年）1:1。在shakB基因突变，编码一个果蝇间隙连接通道（“innexin”），显着增加GF – TTM的途径（1〜1.5毫秒）的响应延迟，而GF – DLM的分支响应（艾伦和墨菲，2007年，费伦等，2008）。突变体的反应，可以恢复直接刺激胸神经节，表明不因扰乱神经肌肉传递的延迟效应。苍蝇GF – DLM和GF – TTM途径通常是能够按照1:1的比例，分别为100赫兹和300赫兹10刺激的野生型相比，这些突变遵循高频刺激的能力也受损。重要的是要注意，这些频率大大高于正常刺激频率，持续飞行（3-10赫兹）（Hummon和Costello，1989年）期间收到由承包肌肉。 用来描述稳定的政府飞行服务队输出的另一个参数是“不应期”，或双刺激脉冲之间的最短的时间内，仍然从肌肉产生两种反应。耐火时间变化TTMS DLMS为7-15毫秒之间1-4毫秒。 DLMS比较长的不应期是由于相对不稳定的PSI – DLMn交界（Tanouye和纬，1980年化学突触; Gorczyca和霍尔，1984年恩格尔和吴，1992年，班纳吉等人 ，2004年，艾伦和Godenschwege 2010年）。
Discussion
一是要注意当试图获得高品质的录音最重要的事情之一，是正确的方向和健康的准备。在理想的情况下，飞仍然活着录音会议结束，电刺激作出反应。对于记录电极，以最有效地穿透胸腔外骨骼，飞应粘在这样一种方式表面与电极形成一个直角，如有必要，插入电极，可通过删除部分的便利钨手术刀背与胸角质层暴露DLM的飞行肌肉（这一步提供一个额外的优势，使其更难打破玻璃电极的提示）。此外，必须小心，以避免通过subcuticularly位于DLMS和TTMS推电极。飞的头应该得到很好的保护，允许要正确插入到大脑的刺激电极，以防止他们在录制过程中会被拉。
由于其规模和良好描述的形态，政府飞行服务队代表在果蝇中最容易获得的神经途径之一。电突触小分子量的示踪染料的渗透性，允许电耦合的神经元的可视化，和几个可用GAL4线，使人们有可能操纵基因的表达水平在细胞或细胞群 （Jacobs 等人，2000年的一个子集;。艾伦等人，2006年除了上述优点，电路显示属性，如习惯性的，自发的复苏和dishabituation传入和胸椎的组成部分，使果蝇的飞行服务队方便的模型系统，为研究神经可塑性（恩格尔和吴） 1996年）。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由威康信托基金赠款支持的LP
Materials
| NAME | COMPANY | CAT. # | COMMENTS |
| S48 Square Pulse Stimulator | Grass Instruments | http://www.grasstechnologies.com/ | |
| Stimulation unit | Grass Instruments | http://www.grasstechnologies.com/ | |
| SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Instruments | http://www.grasstechnologies.com/ | |
| 5A two-channel intracellular Microelectrode Amplifier | Getting Instruments | http://www.gettinginstruments.com/ | |
| Digidata 1440A data acquisition system | Molecular Devices | http://www.moleculardevices.com/ | |
| Analogue-digital Digidata 1320 and Axoscope 9.0 software | Molecular Devices | http://www.moleculardevices.com/ | |
| Recording platform with manual micromanipulators | Narishige, Sutter Ins., World Precision Ins. | http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/ |
|
| Light source | Fostec | http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm | |
| Wild M5 stereomicroscope | Wild Heerbrugg | http://www.wild-heerbrugg.com/ | |
| Vibration isolation table | TMC | http://www.techmfg.com/ | |
| Borosilicate tubing for microelectrodes | Sutter Instrument | http://www.sutter.com/index.html | |
| P-95 Micropipette puller | Sutter Instrument | http://www.sutter.com/index.html | |
| Microfil 34 gauge, 67 mm (electrode filler) | World Precision Instruments | MF34G-5 | http://www.wpi-europe.com/en/ |
| Microdissection tools (forceps,…) | Fine Science Tools | www.finescience.com | |
| Dissecting (stereo) microscope | Leica | http://www.leica-microsystems.com/ | |
| Faraday cage | Unknown manufacturer |
Other: plastic syringes, tungsten earth wire and NaOH-sharpened tungsten electrodes, KCl, wax platform, a PC with monitor…
References
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Electrophysiological RecordingsGiant Fiber PathwayD. MelanogasterStartle ResponseNeuronal CircuitGiant Fiber System (GFS)Giant Fiber InterneuronsAxonsThoracic GanglionCervical ConnectiveMesothoracic Neuromere (T2)Ventral GangliaElectro-chemical SynapsesMedial DendriteIpsilateral Motorneuron (TTMn)Tergotrochanteral Muscle (TTM)Mesothoracic Femur/legPeripherally Synapsing Interneuron (PSI)Cholinergic SynapsesMotorneurons (DLMns)Dorsal Longitudinal Muscles (DLMs)Wing DepressorsDorsovental Muscles (DVMs)Indirect Flight Muscles
Cite This Article
Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster. J. Vis. Exp. (47), e2412, doi:10.3791/2412 (2011).