骨格筋からの前駆体の精製

Summary

酵素的解離、線維/脂肪細胞とマウス骨格筋からの筋原性前駆細胞のフローサイトメトリーによる表面標識および精製方法。

Abstract

骨格筋は、別個の胚起源と発達の可能性の複数の前駆細胞集団が含まれています。筋原性前駆細胞、通常ensheathsそれは、単に筋系統の^1,2にコミットしている自己複製細胞であること。筋線維形質膜とラミニンが豊富な基底膜の間に"人工衛星細胞の位置"に常駐している我々は最近、効率的に増殖を入力して、損傷に応答し、組織再生^3,4中に筋原細胞への栄養サポートを提供する筋線維芽細胞と白色脂肪細胞を生成することができる容器関連する前駆細胞、第二のクラスを記載している。特定の細胞集団の発達と再生の可能性を判断する最も信頼されるアッセイの一つは、彼らの分離および^5-7移植に依存しています。この目的のために我々はこの記事で概説する酵素的に解離した筋肉からのフローサイトメトリー、で、その精製のためのプロトコルを最適化してきました。この方法を用いて得られた個体群は、筋原性または線維/脂肪細胞コロニー形成細胞のいずれかが含まれます：他の細胞型は、in vitroで拡大またはin vivoでの配信で生き残ることができるではありません。ただし、これらの集団は、1つは、新しくソートされたサブセットは、コロニーを形成するか、受信者の生着の能力を欠いている他の汚染物質の細胞を含んでいる可能性があることに留意する必要が分子解析のためのソート（例えば定量RT – PCR）の直後に使用されています。

Protocol

1。組織のコレクション： 7〜12週齢のマウスを使用してください。通常、少なくとも二つの動物が使用されています：一つは補償のために、蛍光マイナスワンアイソタイプコントロールサンプルのための必要なFACS単色のコントロールを設定することです。他には、ソートのための実際のサンプルです。 CO 2吸入によりマウスを安楽死させるかの選択の倫理のプロトコルに従って。場所を上に向けてペーパータオルの上でマウス、およびマウスの毛皮で汚染を防ぐために、徹底的に70％エタノールでスプレー。 鉗子による腹部の皮膚を持ち上げ、鋭いはさみと小さな縦方向のカットを行います。 反対方向に皮膚の二つフラップ（上下）ピール完全に下に後肢の筋肉を公開する。 脛骨の両側に沿ってはさみを挿入して拡張することによって消費税筋肉組織。 筋肉組織を抽出するために大腿骨のための同じプロセスを繰り返します。 各マウスからの組織のために一皿を使用して、60ミリメートルペトリ皿内のすべての摘出した筋肉組織を置きます。 すべてのマウスは、上記を繰り返します。 2。酵素消化によって単一細胞に組織の関連付けを解除します。 プロトコルのこのセクション全体で、滅菌試薬およびツールを使用し、無菌条件下で動作する。 各ペトリ皿にコラゲナーゼIIの2 mLの（シグマ、カタログ番号6885、500U / mL）および250mmのCaCl 2の株式の20μLを追加。 非常に汚染されたとして削除し、破棄する注意を払って、二つの鉗子（一鋸歯状、ファイン科学ツールから2歯を持つもの、、猫＃11051から10、11154〜10）の小さな断片（約1mm 3）に筋肉組織を引き裂く可能な限り、非筋肉組織。 ペトリ皿を覆い、30分間37℃でそれらをインキュベートする。 ペトリ皿を取得し、徹底的にマッシュ組織片に3 mLシリンジのプランジャーを使用してください。汚染を避けるために、サンプルごとに1つのプランジャーを使用してください。 各ペトリ皿にいくつか（〜5mL）を滅菌冷PBSを追加し、（必要なすべての組織を回復する場合ペトリ皿を洗う）50mLのファルコンチューブに組織の汚泥を転送する精力的にファルコンチューブを振る、PBSでチューブを埋める、遠心分離機@約800 rpm × 5分（エッペンドルフのベンチトップモデル：5810R）、そして上清を吸引（繰り返し3回） 37℃でインキュベートし、各チューブにし、CaCl 2の10μL（250MM）：1mLのコラゲナーゼDの混合物（ロシュ、カタログ番号11088882001、1.5U / mL）を/ディスパーゼII（04942078001、2.4u / mLのロシュ、猫＃）を追加する1時間回転で摂氏。 冷たい、滅菌PBS、渦と組織を均質化するピペットの5-10 mLを加え。 PBSでチューブをいっぱいにしてよく混ぜる。 組織の残りの大部分を除外するために50mlのファルコンチューブの上に配置さ40μmのセルストレーナーに液体を移す。均等にthree 50mLのファルコンチューブに各サンプルを分ける。 PBSで各チューブを埋めるには、摂氏8度で5分間@ 1600rpmを遠心してください。 上清を捨て、染色用の細胞を収集する。 3。抗体染色およびソート： プロトコルのこのセクション全体で、無菌のFACSおよびコレクションのバッファを使用し、無菌条件下で動作する。適切に取り扱えば商業抗体は一般に、無菌と考えられている。 単一の色やアイソタイプコントロールサンプルの場合は、1mLのFACS緩衝液でサンプルを再懸濁し、9つの1.5mlのプレ標識したエッペンドルフチュー​​ブ（100μLを各試験管）に懸濁した細胞を分ける。 単一の色の染色を設定し、次の表にしたがってミックス。 注意：染色のアイソタイプコントロール抗体の終濃度は、一次抗体の彼らはのための制御であることと一致していなければなりません。抗Sca – 1が1μg/106セルに使用されている場合例えば、、その対応するアイソタイプは、同じ濃度で使用されている必要があります。 チューブ＃ チューブの名前会社猫＃ クローンアイソタイプ希釈 1 非染色 2 Hoechst33342 シグマ B2261 2-5ug/ml 3 PI シグマ P4864 1ug/ml 4 CD31 – FITC CD45 – FITC ベイバイオサイエンス 11-0311-85 390 ラットIgG2a 500 ハウスは作ら I3 / 2 ラットIgG2b 500 5 SCA1 – PECY7 ベイバイオサイエンス 25-5981-82 D7 ラットIgG2a 5000 6 α- 7 APC ハウスは作ら R2F2 ラットIgG2b 1000年アイソタイプコントロール染色には、次の表を使用して混在させる設定します。 チューブ＃ の名前チューブのヘキスト PI CD31 – FITC CD45 – FITC SCAL – PE – CY7 -7 – APC ラット、 IgG2b – APC ラット、 的なIgG2a – pecy7 ラット、 的なIgG2a – FITC ラット、 IgG2b – FITC 7 ISO – CD31 / CD45 + + – – + + – – + + 8 ISO – SCAL – pecy7 + + + + – + – + – – 9 ISO – α- 7 – APC + + + + + – + – – – ステップ20から適切なエッペンドルフチュー​​ブにピペットで単一色と同位体制御の染色ミックスを（我々は通常ミックスを染色の5〜10μLを各サンプルに追加されているので、抗体の濃度を調整する）。よく混和して、1時間氷上でインキュベートする。 FACSの細胞選別のための抗体のカクテル（下）の800μLを持つサンプルのマウスから細胞を染色。よく混和して、1時間氷上でインキュベートする。 抗体のカクテル：ヘキスト、PI、CD31 – FITC、CD45 – FITC、SCA1 – PECY7、α- 7 APC 注意：重要な違いがバッチ間に存在する可能性があるため、細胞への抗体の最適比は、個別に各抗体を滴定によって決定される必要があります。使用する抗体の最適量は10 6の標的細胞当たりの抗体のμgsで発現し、抗体の同じバッチを使用する際に一定に保つ必要があります。明らかに、標的細胞の数は、実験間で著しく変化しない場合、または染色液は細胞の数を拡大縮小する場合、各抗体の固定希釈にも使用することができます。 洗って：9コントロールチューブの各々にFACS緩衝液の約1mLの追加、サンプルチューブにFACS緩衝液の約20mlのを追加。 5分間エッペンドルフチュー​​ブ@ 3000rpmのを遠心（エッペンドルフベンチトップ遠心機、モデル：5417C）。サンプルチューブを5分間@ 1600rpm（：5810Rエッペンドルフのベンチトップ遠心機、モデル）心する。 すべてのチューブから上清を吸引して捨てます。 FACS緩衝液（コントロールの各1mLの、ソートサンプルの4mlの）に再懸濁し、細胞は、"FACSチューブ"セルストレーナーキャップを通して（BDファルコンの猫＃352235、40μmの孔径）にピペットの細胞は、本資料の残りの塊を除去するサイトメーターに影響を及ぼす。 単一のカラーコントロールおよびアイソタイプコントロールによるFACSソーターを設定します。 別々に3.5mLの収集バッファー（95％DMEM、5％FBS）で、次の表にしたがってソートされた細胞を集めます。通常は、両方の後肢を収穫するときに、単一の野生型のマウスは95％以上の生存率で、15万筋前駆細胞または100,000脂肪細胞前駆細胞について得られることができる、などの手続きの終わり（図1をFACSで再測定し選別された細胞で判断） 表面染色に基づいて、筋原性と脂肪細胞前駆細胞の定義抗体/染色筋原性前駆細胞（MP） 脂肪生成前駆細胞（AP） ヘキスト + + PI – – CD31 – FITC – – CD45 – FITC <td> – – SCA1 – PECY7 – + α- 7 APC + – 4。移植： @ 1500RPMで5分間、オートクレーブエッペンドルフチュー​​ブ（1.5 mL）に上清および転送細胞を除去ソートした細胞を遠心、5分間@ 3000rpmのを遠心分離し、滅菌PBS（血清フリー！）の500μLで細胞をリンス。滅菌条件下で、すべての試薬 ​​を維持し、組織培養フードで働いて、約10 6細胞/ mLのPBSで筋原性前駆細胞、またはマトリゲルで脂肪細胞前駆細胞（BDの猫＃354234）を懸濁します。 レシピエントマウスに筋原性前駆細胞または脂肪細胞前駆細胞を移植。 isoflouranはあなたの機関のポリシーにしたがってマウスをAnaesthetize。 注入領域の周りの毛を剃る、その後70％エタノールでこすって皮膚を消毒する 3月10日CCのインスリン注射器（BDの猫＃309300）を使用して、筋原性前駆細胞または脂肪細胞前駆細胞（= 20K細胞）の20μLを注入する。 適切な時間（3週間も動作しますが、ドナー由来のトランスジェニックマーカーを発現する筋線維は、移植後一週間以内に通常明らかである）の後に、（Sigmaカタログ＃T04840 – 2、400μLAVERTINの腹腔内注射することにより、ステップ29からのレシピエントマウスをanaesthetize 25 mg / mL）は、その後、4％PFAの15mlのに続いて50mLのPBS（EDTAの10μMを含む）最初の、とtranscardially灌流。必要に応じて、一晩20％ショ糖に転送し、一晩4％PFAで標的組織、ポストフィックスを収集する。 OCT、凍結および凍結切片に埋め込みます。 5。代表的な結果： MPがマウス骨格筋に移植されると、彼らは容易に既存の筋線維と融合。したがって、ドナー細胞中に存在する遺伝子のラベルは、それを受信した繊維で容易に検出可能となります。図2に移植された細胞は、ヒトアルカリphostphataseを発現する組織化学的に明らかにした例を示しています。 APが移植されている場合、結果は移植部位の環境に大きく依存しています：（図2参照）これらの細胞は脂肪細胞や筋線維芽細胞に起源を与える皮下移植したとき。脂肪変性は3を誘導されていない限り、筋肉を含む他の多くのサイトで、で、彼らは生きていけない。 図1。骨格筋からの前駆細胞集団の分離のための戦略をソート （）戦略ソート：生存細胞は前方散乱と側方散乱に基づいて同定されたが。ヘキスト染色は、死細胞を除外するために無核の残骸とヨウ化プロピジウム（PI）染色を除外するために使用されました。造血（CD45）と内皮（CD31）の細胞をソーティングゲートから除外した。 α7+ヘキスト+ PI – CD45 – CD31 – SCAL -サブセットは、すべての筋原性前駆細胞（MP）が含まれています。 SCAL +ヘキスト+ PI – CD45 – CD31 – α7 -人口は、脂肪細胞前駆細胞（AP）が含まれています。 （B）蛍光マイナスワン（FMO）アイソタイプコントロール染色の特異性を確認する。 （C）純度は、ソート後のMPとAPのサブセ​​ットをチェックします。 図2。 MPとAP移植後の代表的な結果。APは、皮下に移植（上部パネル）とMP筋肉内（下部パネル）された。どちらの場合も、ドナー細胞は、茶色の染色によって同定された遺伝子組換えヒトアルカリホスファターゼを発現するマウス由来。

Discussion

このプロトコルの目的は、高収率および精製した細胞の高い生存の間に合理的なバランスを取ることです。健康な細胞を回収されていることを確保する上で最も重要なステップは、予想通り、出発組織の酵素的解離です。組織の取扱いは、デモンストレーションや視聴覚の形式でも鑑賞するのは困難である、特に穏やかなはずです。もう一つの重要な要素は、プロシージャの長さです。もはやそれは、したがって、より低い生存率と、生着効率、ドナーからレシピエント動物に移動されます。すぐにソートした後、精製した細胞サンプル中のPI肯定的な出来事の頻度を見ることによって応答されていない実行可能性についての質問があるはず、私たちはclonogenicityを測定するために限界希釈アッセイは^3を実行されることを示唆している。無傷の筋肉からの典型的なソートは、日常的にin vitroでの筋原性または線維/脂肪細胞コロニーを開始することのできる15から20まで細胞内で約1が得られる。国会議員から開始されたコロニーの本質的に100％は差別化された筋管を含んでいますが、FAPSから得られたコロニーの約3分の1は、平滑筋アクチン正の筋線維芽細胞に加えて脂肪細胞が含まれています。

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C-6885,	500 u/ml
Collagenase D	Roche	11088882001	1.5 u/ml
Displace II	Roche	04942078001	2.4 u/ml
cell strainer	BD	352340	40 μm
Tube with cell strainer	BD	352235	40 μm
Hoechst33342	Sigma-Aldrich	B2261	2-5 ug/ml
CD31-FITC	Ebiosciences	11-0311-85	Clone 390
CD45-FITC	Home made		Clone I3/2
Sca1-PECY7	Ebiosciences	25-5981-82	Clone D7
α-7 integrin APC	Home made	Inquire with Rossi lab	R2F2