מניפולציה מכני של נוירונים שליטה פיתוח axonal
Summary
יישום ישיר מדידות של כוחות על הנוירונים בטווח 2000-1000 microdyne מושגות עם דיוק גבוהה באמצעות מחטים זכוכית מכויל. מתודולוגיה זו ניתן להשתמש כדי לשלוט ולמדוד כמה היבטים של התפתחות axonal, לרבות ייזום axonal, מתח axonal, מהירות של התארכות axonal ו וקטורים כוח.
Abstract
מניפולציות תאים הרחבה של אקסונים עצבי יכול להתבצע עם זכוכית מכויל מיקרו סיבי מסוגל למדוד וליישם כוחות 1,2 μdyne 1-10 טווח. מדידות חיל מתקבלים באמצעות תצפית של Hookean כיפוף של מחטים זכוכית, אשר מכויל על ידי שיטה ישירה אמפירי 3. דרישות ציוד ונהלים בודה, כיול, טיפול, ושימוש במחטים על תאים מתוארים באופן מלא. כוח המשטרים סוגי תאים המשמשים בעבר השונים אשר טכניקות אלה יושמו להדגים את הגמישות של המתודולוגיה ומקבלים כדוגמאות לחקירה בעתיד 4-6. היתרונות הטכניים של ראיה 'מתמדת של כוחות המיוצר על ידי המניפולציות ואת היכולת להתערב באופן ישיר במגוון רחב של אירועים הסלולר. אלה כוללים גירוי ישיר ורגולציה של צמיחה axonal לבין הפתיחה 7, כמו גם ניתוק מדידות מכניות על כל סוג של תאים בתרבית 8.
Protocol
1. ביצוע מחטים זכוכית. חולץ מתכווננת מיקרו מחט משמש לפברק מחטים עם קצה קוני על 4 מ"מ באורך סגורות קורות מוצק. בניגוד קצה גמיש ארוך, זה קצר באורך 4 מ"מ גבולות תנודות של קצה המחט במהלך הניסויים. באותו האזור הפרוקסימלי …
Discussion
טכניקות ליישם ולמדוד כוחות הסלולר יש היסטוריה ארוכה 9. השיטה שלנו נבעה במקור על ידי העבודה של דניס בריי, שהשתמשו במחטים זכוכית דומה לשלנו לנוירונים "גרירה" בקצב קבוע באמצעות מכשיר הידראולי ממונע 10. ישנם אמצעים חלופיים רבים של החלת כוחות תאים הכוללים: …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו בתודה להכיר התרומות החשובות של ד"ר רוברט בוקסבאום בפיתוח מתודולוגיה זו.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific Co., Broomall, PA, USA | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8″ | |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 | |
| 0.001″ Chromel wire | Omega Engineering, Stamford, CT, USA | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega | |
| 0.003″ Constatan wire | Omega Engineering, Stamford, CT, USA | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool | |
| fine forceps | Fine Science Tools, USA | 91150-20 | Dumont Inox #5 | |
| universal microscope boom stand | Nikon | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use | |
| mechanical micromanipulator | Narishige | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator | |
| hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type | |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 | |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | ||
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | ||
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 | |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | ||
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | ||
| Vibraplane isolation table | Kinetic System, Boston, MA, USA | 1200 series | ours is model 1201-02-12 | |
| Ringcubator | self manufactured see reference 19 | reference 19, requires updated controller listed below | ||
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller | |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments, Inc. | inverted microscope, circa 1980 | ||
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments, Inc. | other dissecting microscopes will work |
References
- Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation. J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).
- Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons. J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Haynes, L. W. . The Neuron in Tissue Culture. , 105-119 (1999).
- Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. Rac is required for growth cone function but not neurite assembly. J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts. J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).
- Yoneda, M. Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1. Journal of Experimental Biology. 37, (1960).
- Bray, D. Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture. Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Fass, J. N., Odde, D. J. Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads. Biophys J. 85, 623-636 (2003).
- Yang, S., Saif, M. T. A. Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response. Exp Mech. 49, 135-151 (2009).
- Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites. Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Direct evidence that growth cones pull. Nature. 340, 159-162 (1989).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Growth cone behavior and production of traction force. J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).
- O’Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope. Biotechniques. 35, 708-708 (2003).
Tags
Mechanical ManipulationNeuronsControlAxonal DevelopmentGlass Micro-fibersForcesHookean BendingCalibrationEquipment RequirementsProceduresFabricatingTreatingCellsForce RegimesCell TypesFlexibilityMethodologyInvestigationVisualizationDirect InterventionCellular EventsStimulationRegulationAxonal GrowthRetractionDetachment
Cite This Article
Lamoureux, P., Heidemann, S., Miller, K. E. Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development. J. Vis. Exp. (50), e2509, doi:10.3791/2509 (2011).