Manipolazione meccanica di neuroni di controllo per lo sviluppo assonale
Summary
Misure di applicazione e diretto di forze sui neuroni nel range 2000-1000 Microdyne sono realizzati con la massima precisione utilizzando aghi di vetro calibrato. Questa metodologia può essere utilizzato per controllare e misurare diversi aspetti dello sviluppo assonale, incluso l'avvio assonale, tensione assonale, la velocità di allungamento assonale e vettori di forza.
Abstract
Manipolazione delle cellule e l'estensione degli assoni neuronali può essere realizzato con vetro calibrato micro-fibre in grado di misurare ed applicare le forze in campo μdyne 1,2 1-10. Misure di forza sono ottenute attraverso l'osservazione del Hookean flessione degli aghi di vetro, che sono tarati con un metodo diretto ed empirica 3. Requisiti attrezzature e le procedure per la fabbricazione, la calibrazione, il trattamento, e utilizzando gli aghi sulle cellule sono descritti. La forza di regimi di tipi di cellule precedentemente utilizzati e diversi a cui queste tecniche sono state applicate dimostrano la flessibilità della metodologia e sono dati come esempi per la ricerca futura 4-6. I vantaggi tecnici sono il continuo 'visualizzazione' delle forze prodotte dalle manipolazioni e la possibilità di intervenire direttamente in una varietà di eventi cellulari. Questi includono la stimolazione diretta e regolazione della crescita assonale e retrazione 7; così come distacco e di misure meccaniche su qualsiasi tipo di cellule in coltura 8.
Protocol
Discussion
Tecniche da applicare e misurare le forze di cellulari hanno una lunga storia 9. Il nostro metodo è stato originariamente motivato dal lavoro di Dennis Bray, che ha usato gli aghi di vetro simile al nostro a 'trainare' i neuroni a velocità costante utilizzando un dispositivo motorizzato idraulico 10. Ci sono molti mezzi alternativi di applicare forze di cellule che comprendono: motori passo-passo 11, perline magnetico da 12, travi microfabbricazione 13 e f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Noi riconosciamo con gratitudine gli importanti contributi del Dr. Robert E. Buxbaum nello sviluppo di questa metodologia.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific Co., Broomall, PA, USA | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8″ | |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 | |
| 0.001″ Chromel wire | Omega Engineering, Stamford, CT, USA | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega | |
| 0.003″ Constatan wire | Omega Engineering, Stamford, CT, USA | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool | |
| fine forceps | Fine Science Tools, USA | 91150-20 | Dumont Inox #5 | |
| universal microscope boom stand | Nikon | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use | |
| mechanical micromanipulator | Narishige | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator | |
| hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type | |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 | |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | ||
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | ||
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 | |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | ||
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | ||
| Vibraplane isolation table | Kinetic System, Boston, MA, USA | 1200 series | ours is model 1201-02-12 | |
| Ringcubator | self manufactured see reference 19 | reference 19, requires updated controller listed below | ||
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller | |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments, Inc. | inverted microscope, circa 1980 | ||
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments, Inc. | other dissecting microscopes will work |
References
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