Bioenergetic प्रोफाइल C2C12 Myoblast कक्ष का उपयोग कर प्रयोग
Summary
कोशिकाओं में mitochondrial समारोह की रूपरेखा के लिए एक विधि का वर्णन प्रदान की है. बेसल श्वसन दर, श्वसन एटीपी जुड़े, प्रोटॉन रिसाव, और आरक्षित क्षमता: mitochondrial उत्पन्न प्रोफ़ाइल mitochondrial समारोह के चार मापदंडों है कि एक प्रयोग में मापा जा सकता है है प्रदान करता है.
Abstract
सेलुलर चयापचय को मापने के लिए और mitochondrial रोग को समझने की क्षमता, उनके शोध मोटापे में mitochondrial समारोह की भूमिका, मधुमेह, उम्र बढ़ने, कैंसर, हृदय समारोह और सुरक्षा विषाक्तता को समझने में अग्रिम करने के लिए दुनिया भर के वैज्ञानिकों सक्षम है.
सेलुलर चयापचय सब्सट्रेट तेज, जैसे ऑक्सीजन, ग्लूकोज, फैटी एसिड, और glutamine, और enzymatically नियंत्रित ऑक्सीकरण और कमी प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से बाद में ऊर्जा रूपांतरण की प्रक्रिया है. इन intracellular एटीपी, लैक्टेट और बाह्य वातावरण में सीओ 2 के रूप में में गर्मी और रासायनिक byproducts की रिहाई के उत्पादन में जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं का परिणाम है.
ऑक्सीजन की खपत दर – या ओसीआर कक्षों की शारीरिक स्थिति, और उन कोशिकाओं के राज्य के परिवर्तन में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि, ऑक्सीजन कोशिकाओं, mitochondrial श्वसन का एक संकेतक द्वारा खपत की दर को मापने के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. कक्ष भी ग्लाइकोलाइसिस के माध्यम से एटीपी उत्पन्न, अर्थात्: ग्लूकोज की लैक्टेट के लिए रूपांतरण, ऑक्सीजन की स्वतंत्र. सुसंस्कृत कुओं में लैक्टेट प्रोटॉन का प्राथमिक स्रोत है. मापने या ECAR – लैक्टिक एसिड प्रोटॉन कोशिकी कोशिकाओं के आसपास के मध्यम में जारी है, जो का कारण बनता है मध्यम के अम्लीकरण अम्लीकरण अतिरिक्त सेलुलर दर प्रदान करता है के माध्यम से परोक्ष रूप से उत्पादन.
इस प्रयोग में, C2C12 myoblast कोशिकाओं Seahorse सेल संस्कृति प्लेटों में एक दिया घनत्व वरीयता प्राप्त हैं. बेसल ऑक्सीजन की खपत (ओसीआर) और बाह्य अम्लीकरण दर (ECAR) आधारभूत दरों को स्थापित करने के लिए मापा जाता है. कोशिकाओं तो metabolically विभिन्न यौगिकों के तीन परिवर्धन (उत्तराधिकार में) है कि सेल के bioenergetic प्रोफ़ाइल बदलाव से परेशान.
इस परख mitochondria के आकलन के लिए एक क्लासिक प्रयोग से ली गई है और एक रूपरेखा के साथ जो और अधिक जटिल mitochondria की दोनों शारीरिक और pathophysiologic समारोह को समझने के उद्देश्य से प्रयोगों का निर्माण करने के लिए और करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता को तनाव और / या अपमान का जवाब की भविष्यवाणी रूप में कार्य करता है.
Protocol
Discussion
इस परख क्लासिक mitochondrial समारोह जांच प्रयोग से ली गई है और अधिक जटिल प्रयोगों सेल चयापचय, mitochondrial समारोह, और समग्र bioenergetics में विभिन्न परिवर्तनों को समझने के उद्देश्य से निर्माण के साथ एक रूपरेखा के रूप में कार्य करता है.
सभी इस प्रयोग में इस्तेमाल यौगिकों एकाग्रता है कि अधिक से अधिक प्रभाव प्रदान करता है के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. यही कारण है, एक अलग अनुमापन प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए इन मूल्यों का पता लगाना चाहिए. यह FCCP के साथ विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, अनुमापन वक्र के रूप में काफी तेज हो जाता है, और बहुत अधिक FCCP वास्तव ओसीआर में प्रतिक्रियाओं कम कर सकते हैं. विशिष्ट पर्वतमाला (अंतिम सांद्रता) परीक्षण करने के लिए होगा:
- 0,1 – 1,0 / स्नातकीय Oligomycin के एमएल
- 0,1 – 5,0 उम FCCP
- 0,1 – 1,0 उम Rotenone
ध्यान दें कि ऊपर प्रत्येक यौगिक (विशेष रूप से FCCP) करने के लिए प्रतिक्रियाओं परख मीडिया संरचना (आधार प्रकार, [ग्लूकोज], [पाइरूवेट] / BSA की उपस्थिति या अनुपस्थिति, आदि) से प्रभावित हो जाएगा. इसके अलावा, अगर एक्सएफ परख मीडिया संरचना बदल गया है, अनुकूलन के लिए फिर से प्रदर्शन किया जा आवश्यकता होगी. उपस्थिति की एकाग्रता और पाइरूवेट FCCP के लिए अधिक से अधिक श्वसन कारण क्षमता प्राप्त करने में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. बायोसाइंस Seahorse कोशिकाओं लाइनों की एक संख्या में देखा गया है कि पाइरूवेट की चूक कोशिकाओं की क्षमता के लिए ज़्यादा से ज़्यादा FCCP (आधारभूत ऊपर) जवाब abrogates. आमतौर पर, 1-10 मिमी पाइरूवेट की सांद्रता पाइरूवेट के इष्टतम एकाग्रता को समझने के लिए अधिक से अधिक श्वसन प्राप्त करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. नोट करें कि [पाइरूवेट] और [ग्लूकोज] हो "पार titrated" के प्रयोग के लिए इष्टतम मीडिया शर्तों प्राप्त करने की आवश्यकता हो सकती है.
इस प्रयोग की विशिष्ट परिणाम के नीचे एक ओसीआर समय और दूसरे दिखा ECAR समय बनाम बनाम दिखा ग्राफ में प्रस्तुत कर रहे हैं:
चित्रा 2. ओसीआर बनाम समय
चित्रा 3. ECAR बनाम समय
यहाँ हम ओसीआर और ECAR में उम्मीद प्रतिक्रियाओं मनाया के रूप में कोशिकाओं को एक के बाद एक परिसर के साथ इलाज कर रहे हैं. Oligomycin के लिए, ओसीआर mitochondrial परिसर में वी. चूंकि कोशिकाओं OXPHOS के माध्यम से एटीपी synthesize करने में असमर्थ हैं, वे ग्लाइकोलाइसिस पर वापस लौटने के लिए एटीपी के लिए उनकी मांग को पूरा एटीपी संश्लेषण अवरुद्ध का एक परिणाम के के रूप में घट जाती है, इस प्रकार हम ECAR में वृद्धि का पालन करें. जैसा कि पहले दिखाया गया है, FCCP एक uncoupling एजेंट के रूप में कार्य करता है. चूंकि कोशिकाओं अब भीतर mitochondrial झिल्ली भर प्रोटॉन रिसाव पर काबू पाने चाहिए, ओसीआर काफी बढ़ जाती है के रूप में और अधिक O2 के अतिरिक्त प्रोटॉन mitochondrial झिल्ली के पार वापस पंप सेवन किया जाता है. अंत में, rotenone mitochondrial परिसर मैं और परिसर III रोकता है, क्रमशः है, जो इलेक्ट्रॉनों के प्रवाह इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में संघर्ष का कारण बनता है, और इस तरह O2 की खपत काफी कम है.
चित्रा 4 श्वसन पैरामीटर.
श्वसन और ECAR में उम्मीद परिवर्तनों के अलावा, श्वसन मानकों के एक नंबर इस डेटा से प्राप्त किया जा सकता है. यह उपरोक्त आंकड़े में संक्षेप:
यहाँ हम देखते हैं कि हम कोशिकाओं के बेसल श्वसन, O2 एटीपी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रोटॉन ढाल (एच + रिसाव कारण) को बनाए रखने के लिए समर्पित की राशि के उत्पादन के लिए समर्पित की खपत के प्रतिशत के बारे में जानकारी प्राप्त कर सकते हैं. इसके अलावा, हम uncoupled श्वसन (कभी कभी के रूप में स्पेयर श्वसन क्षमता संदर्भित) की शर्तों के तहत अधिक से अधिक श्वसन दर प्राप्त है और अंत में, हम mitochondrial प्रक्रियाओं के कारण नहीं O2 की खपत की राशि निर्धारित कर सकते हैं हो सकता है.
अध्ययन का एक तेजी से बढ़ती संख्या इस mitochondrial प्रोफ़ाइल रोजगार कर रहे हैं सेलुलर bioenergetics का आकलन, mitochondrial रोग की पहचान करने और कोशिकाओं की क्षमता की भविष्यवाणी करने के लिए और / या अपमान तनाव का जवाब. और इस प्रयोगात्मक विधि और स्पेयर सांस की क्षमता के विचार के बारे में अधिक जानकारी जानकारी के लिए, कृपया निम्नलिखित 1-8 प्रकाशनों के लिए उल्लेख देख.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions | Seahorse Bioscience | Seahorse Mito Stress Test Kit | ||
| DMEM Running Media | Seahorse Bioscience | 100965-000 | ||
| DMSO | Sigma | D8418 | ||
| Distilled Water | Gibco | 15230-170 | ||
| Calibration buffer | Seahorse Bioscience |
References
- Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochem J. 424, 99-107 (2009).
- Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway. Nature. , 459-7245 (2009).
- Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion. J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).
- Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).
- Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor. Biochem J. 428, 255-267 (2010).
- Morán, M., Rivera, H., Sánchez-Aragó, M., Blázquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Martín, M. A. Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts. Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).
- Cárdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molgó, J. Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria. Cell. , 142-142 (2010).
