使用泛病毒基因芯片检测（Virochip）屏幕病毒病原体的临床标本
Summary
Virochip是一个泛病毒的芯片设计，同时检测保守序列同源性的基础上所有已知的病毒，以及新颖的病毒。在这里，我们演示了如何运行的Virochip检测，分析存在的已知和未知病毒的临床样本。
Abstract
该病毒会导致许多传染病的诊断，由于固有的病毒序列的多样性以及持续出现新型病毒的病原体，如SARS冠状病毒和2009年H1N1新型流感病毒，是不是用传统的方法检测，很难。为了应对这些挑战，我们以前开发和验证一个泛病毒的基因芯片平台与检测能力上的保守序列的同源性1的基础上所有已知的病毒以及新颖变种Virochip。使用的Virochip，我们已经确定了相关病毒与呼吸道感染，包括原因不明的重大疾病住院的患者案件，灵敏度相当于或优于传统的临床试验 2-5，全方位。 Virochip也被用来确定新的病毒，包括SARS冠状病毒6,7，一种新型的鼻病毒分支5，XMRV病毒（逆转录病毒与前列腺癌）8，禽流bornavirus（消耗性疾病在鹦鹉的原因）9 ，小说和儿童呼吸道疾病和腹泻病10 cardiovirus。 Virochip目前的版本已经被移植到安捷伦的芯片平台，并根据截至2009年12月从GenBank中的病毒超过1500〜〜36000探头组成。在这里，我们展示了在处理Virochip检测从开始涉及的步骤来完成（〜24小时的周转时间），包括样品核酸的提取，使用随机引物的PCR扩增，荧光染料掺入，与芯片杂交，扫描，并分析。
Protocol
Virochip检测的步骤包括：（1）从临床标本的核酸提取，（2）提取的RNA 逆转录和第二链cDNA合成，（3）随机引物的cDNA PCR扩增，（3）Cy3标记的荧光染料掺入（4）杂交标记的材料Virochip芯片，（5）扫描和分析（图1）。如下图所示的协议，将展示从儿童流感样病例鼻拭子样品的Virochip检测上使用。 引物序列引物5' – GTTTCCCAGTCACGATA（N 9）-3“ 引物乙5' – GTTTCCCAGTCACGATA – 3“ 1。核酸提取从临床标本的核酸提取应执行2级生物安全（BSL – 2）或更高的条件下，这些样本有潜在的传染性。 鼻拭子样本运送病毒控股中期。分装200μL的样品至1.5毫升的Eppendorf离心管。 可选：通过样品通过0.22微米的过滤器（净化病毒颗粒） 可选：用DNase（降解宿主基因组DNA和净化保护，encapsidated病毒核酸每制造商的说明使用的Turbo DNA酶试剂盒（Ambion公司）的预处理，样品） 提取的样品使用Zymo ZR的病毒RNA提取试剂盒或每Qiagen公司Ultrasens病毒试剂盒制造商的指示。 2。逆转录和第二链cDNA合成（“回合一个”） 1 UL 40 pmol /μL底漆4 UL提取RNA。加热至65 °让C为5分钟在一个热循环仪（例如GeneAmp PCR系统9700），然后在室温× 5分钟冷却。 添加5μL2微升5X RT缓冲液，1μL12.5毫米的dNTP，1μL水，0.5μL0.1M数码地面电视，0.5μL，SSIII RT（Invitrogen公司）组成的一个主混合。在42 ° C孵育× 60分钟。 在一个可编程的热循环，加热至94 ° C X 2分钟（中止逆转录反应），冷却至10 ° C，脉冲离心机，然后加入5μLSequenase 1μL5X Sequenase缓冲液，3.8μL水组成的混合，和0.15μLSequenase（USB公司）。 第二链的合成，斜10 ° C至37 ° C，超过8分钟，保持8分钟，然后加热至94 ° C X 2分钟（灭活Sequenase），冷却至10 ° C（按住）。 路可选 ：一个样品的cDNA在这一点上可以存储在-20 ° C。 3。随机引物PCR扩增的cDNA（“B轮”） 5路UL A样品添加45μL5μL的10X PCR缓冲液，1μL12.5毫米的dNTP，1μL100 pmol /μL引物b，1μL，KlenTaq LA（Sigma公司），以及37μL水组成的混合主。 运行PCR协议如下：94 ° C，2分钟→（25周期94℃，30 S / 50 ° C，45秒/ 72 ° C，1分钟）→72 ° C，5分钟→10 ° C（持有） 路B瓶检查在1.5％琼脂糖凝胶电泳凝胶。涂片从约200 – 1000 BP应可视化（图2A） 4。 Cy3标记荧光染料法团 可选 ：另一样品可与Cy5的荧光染料标记相同的芯片杂交。 要结合AA -的dNTP，添加5号B瓶UL UL主组成的混合5 UL 10X PCR缓冲液，1 UL 12.5毫米AA -的dNTP（Invitrogen公司），1 UL 100 pmol / UL引物b，1至45， 1 UL KlenTaq洛杉矶（Sigma公司），和37 uL的水。运行PCR协议如下：94 ° C，2分钟→（15周期94℃，30 S / 50 ° C，45秒/ 72 ° C，1分钟）→72 ° C，5分钟→10 ° C（持有） 清洁道中的样本DNA清洁和每制造商的指示选矿厂5包（Zymo研究）。洗脱10微升。 新增1 UL 1M碳酸氢钠（Sigma）和1 UL Cy5的（通用电气医疗集团）号彗星样本。 孵育1个小时在黑暗中。 清洁Cy3标记的样本DNA清洁和每制造商的指示选矿厂5包（Zymo研究）。洗脱12微升。 5。杂交Virochip芯片 可选：使用1.5μL检查cDNA的浓度和染料的金额纳入上Nanodrop分光光度计（样本正常化） 在PCR地带管添加1μL的25X碎片缓冲区，5μL的5倍封闭液，9.5μLCy3标记，标记的样品（或金额正常化），和水的总体积至25μL（安捷伦） 加入25μL2X GEX杂交缓冲液（安捷伦）。离心简单，赶走气泡。 加载到垫片幻灯片40μL的样品。 广场安捷伦印Virochip阵列（Californi大学旧金山/安捷伦）（标有“安捷伦”下来方）垫片幻灯片上并拧紧螺钉紧。 杂交一夜之间在65 ° C烘箱，在10转的速度设置。 清洗阵列，预热缓冲区2（安捷伦）至37 ° C。除了在缓冲区1（安捷伦）垫片幻灯片/阵列夹心水下。在缓冲区1 × 1分钟洗净。洗，在预热的缓冲2 × 1分钟。慢慢地从缓冲区2中删除的幻灯片，要小心，以避免气泡（使用kimwipe到灯芯掉多余的水分，要小心，以避免直接接触阵列的主动方） 成幻灯片固定放置幻灯片和插入阵列扫描仪。 6。 Virochip扫描和分析扫描Cy3标记在5微米或根据仪器的标准扫描协议（图2B）2微米阵列。 通过目测，聚类分析，或自动化Virochip分析程序分析Virochip芯片，电子预测11。这三种方法，流感病毒很容易发现在鼻拭子样本（从流感样病例的孩子）（图2C） 7。代表性的成果： 是正确的协议时，应看到涂片，在琼脂糖凝胶电泳后的路乙一步（图2A）。安捷伦平台上Virochip芯片将难以直观分析（图2B），但如果病毒是目前应随时确定目视检查，聚类分析，和/或E -预测（图1C）。样品可以添加与测量，从已知的病毒（如烟草花叶病毒的MS2噬菌体）核酸作为一个检测的阳性对照的数量。 图1。随机扩增示意图Virochip芯片处理和分析 ，从临床标本中提取核酸，用荧光染料标记，杂交Virochip芯片。在2微米分辨率的微阵列扫描和使用各种计算工具，包括电子预测分析。 图2。在Virochip检测的步骤后随机，涂抹200 PCR扩增- 1000 BP可以用凝胶电泳观察（一）（二 ）三个Virochip微阵列8阵列/玻片上显示，与一个小区域。一吹，在右下角的插图芯片（C）使用E自动芯片病毒分析预测揭示了A型流感病毒的临床样本的存在。很高的相似性得分（S = 0.55）对应的p值接近于零，从而使这一极其显着的预测。
Discussion
此处所述的Virochip协议是复杂的，需要细致和熟练的科研技术人员。正确的试剂浓度和PCR，标签条件，和杂交是至关重要的。 Virochip协议可以很容易地修改，以适应分析病变组织的组织提取方法，如TRIZOL（Invitrogen）的核酸提取使用。探头可以在必要时添加或删除，以获得所需的频谱和覆盖的广度，例如，可以设计和探针检测的细菌和真菌，如非病毒的目标“飞”的补充。 Virochip检测目前正在开发的一些应用，包括在临床实验室，疫情调查，纯度的药物和疫苗的筛选，和新的病毒病原发现的广谱病毒诊断。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢王大卫，阿纳托利Urisman，艾米奇石，Kael菲舍尔，邓健泓，和亚历山大Greninger的初步发展和优化的Virochip协议。这项工作是支持K08授予美国国立卫生研究院和雅培发现奖（消委会）和霍华德休斯医学研究所（JLD）。
Materials
| Name of reagent / material | Name of reagent / material |
|---|---|
| PrimerA | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9)-3′ |
| Primer B | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-3′ |
| RT Master Mix (5 μL) | 2 μL 5X RT buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL water | |
| 0.5 μL 0.1M DTT | |
| 0.5 μL SSIII RT (Invitrogen) | |
| Sequenase Mix (5 μL) | 1 μL 5X Sequenase buffer |
| 3.8 μL water | |
| 0.15 μL Sequenase (USB Corporation) | |
| Rd B PCR Master Mix (45 μL) | 5 μL 10X PCR buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL 100 pmol / μL primer B | |
| 1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
| 37 μL water | |
| Rd C PCR Master Mix (45 μL) | 5 uL 10X PCR buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL 100 pmol / μL primer B | |
| 1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
| 37 μL water | |
| Hybridization buffer (25 μL) | 1 μL 25X fragmentation buffer (Agilent) |
| 5 μL 5X blocking buffer (Agilent) | |
| 9.5 μL (or amount to normalize) of Cy3-labeled sample | |
| Add water to total volume of 25 μL | |
| Agilent Virochip microarray | license pending; available from Chiu laboratory, UCSF |
References
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Cite This Article
Chen, E. C., Miller, S. A., DeRisi, J. L., Chiu, C. Y. Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens. J. Vis. Exp. (50), e2536, doi:10.3791/2536 (2011).