mStrawberry OP9 клетки позволяют всесторонней оценки всех ES полученных потомством от совместного культуры.
В пробирке дифференциации ЭС клеток по отношению к судьбе гемопоэтических ячейки полезна при изучении клеточных популяций, которые трудно получить доступ в естественных условиях и для характеристики ранних генов, участвующих в кроветворении, без необходимости иметь дело с эмбриональными lethalities. ES/OP9 совместно культуры система изначально была разработана для получения кроветворных потомства, не над производством макрофагов, как OP9 стромальных клеточной линии происходит от черепа из остеопетроз мутантных мышей, которые не имеют функциональных M-CSF. В пробирке ES/OP9 совместно культуры система может быть использована для того, чтобы резюмировать ранних гемопоэтических развития. При культивировании на OP9 стромальные клетки, стволовые клетки дифференцируются в Flk-1 + hemangioblasts, кроветворной предков, и, наконец, зрелые, терминально дифференцированные линий. Стандартный ES/OP9 совместно культуры протокол предусматривает размещение ЭС клеток на сливной слой OP9 клеток; а также, периодические replating шаги, чтобы удалить старые, загрязняя OP9 клеток. Кроме того, текущие протоколы включают оценку только гемопоэтические клетки, находящиеся во взвешенном состоянии и не оптимизированы для оценки ЭС полученных потомством на каждый день дифференциации. Однако, с replating шаги и уборки только клетки, подвески могут оказаться одной из пропускает большую часть ES полученных потомством и развитие кроветворных клеток. Этот вопрос приобретает важное значение для решения при попытке охарактеризовать гемопоэтических дефектов, связанных с линиями нокаутом ES. Здесь мы опишем изменение ES / mStrawberry OP9 со-культуры, которая позволяет по ликвидации загрязнения OP9 клетки вниз по течению анализов. Этот метод позволяет всесторонней оценки всех ES полученных потомством на все дни со-культуры, в результате чего гемопоэтических картина дифференциации, которые более непосредственно соответствует гемопоэтических картина дифференциации наблюдается в зародыше.
Правильное дифференцировку ЭС клеток на сливной слой mStrawberry OP9 клеток приводит к производству Flk1 hemangioblasts + на 5-й день со-культуры. Hemangioblasts должен выглядеть свалили мутовках клеток, как это наблюдалось на рисунке 1. В течение оставшейся части со-культуре, видимыми ES-производные потомство должно появиться в виде кластеров гемопоэтических клеток (рис. 1). На Day6 / 7 3:58 кластеры клетка должна появиться и развиваться в более крупные ячейки кластеров (как приверженец и в виде суспензии) на День 8 / 9 от со-культуры. Другие ES производные потомство находятся также тесно связаны в приверженцем стромального слоя клеток.
Хотя это и не перечислены в протоколе, он имеет решающее значение для предварительного тестирования FBS используется в среде ES роста, mStrawberry OP9 питательной среды и ES / mStrawberry OP9 СМИ дифференциации. Правильно испытания сыворотки должны обеспечить должный рост mStrawberry OP9 клеток, а также, в надлежащих дифференцировку ЭС клеток в со-культуры до 5 день дифференциации. В качестве альтернативы или в дополнение к mStrawberry OP9 клеток, OP9 клетки могут быть облученные, в 8000 рад, до посева на слияния (7.8×10 4 клеток / см 2). Облучение OP9 клетки позволяет устранение повторяющихся replating шагов, а также, позволяет почти полная ликвидация старых, загрязняющих OP9 клетки вниз по течению анализов.
OP9 клетки были спроектированы, чтобы выразить mStrawberry белка трансдуцирующих OP9 клеток с 3ug/mL из лентивирусов вектор выражения mStrawberry под контролем промотора CMV (pRRLsin-CMV вектор, вектор UCLA ядро).
Стандартный ES/OP9 совместно культуры протоколов повлечь за собой размещение ЭС клеток на сливной слой OP9 клеток, а также, в 5-й день replating шаг, чтобы уменьшить старые, загрязняя OP9 клетки из ячейки проход. Кроме того, только гемопоэтические клетки, находящиеся во взвешенном состоянии удаляются для оценки ЭС полученных потомством. Тем не менее, как с replating шаг и уборки только клетки, подвески могут оказаться одной из пропускает значительное число развивающихся ES-производные гемопоэтических клеток. Этот вопрос приобретает важное значение для решения при попытке охарактеризовать гемопоэтических дефектов, связанных с линиями нокаутом ES. Для того чтобы обойти этот вопрос нашей лаборатории использовали модифицированный совместно культуры, за счет использования mStrawberry экспрессирующих OP9 клеток. Это гарантирует, что все ES потомству передаются на продолжение сотрудничества культуры в 5-й день, а для урожая всех ES полученных потомством для последующих анализов. Эта модификация обеспечивает полезными инструментами оценки и характеристика гемопоэтических потомства основе как человеческие, так и линии мыши ES.
Это ES-mStrawberry OP9 совместно культуры модель повторяет различных стадиях примитивным и окончательное кроветворения. При изучении ранних этапов развития кроветворной, многие люди используют BL-CFC (Blast-подобные колониеобразующих клеток) анализа, которые позволяют оценить развитие hemangioblast из ЭСК. Хотя BL-CFC анализ является полезным инструментом при исследовании ранних гемопоэтических развития, mStrawberry-ES совместно культуры системах экспонатов увеличения утилиты, так как позволяет для оценки hemangioblast, а также, более взрослый гемопоэтических линий.
Предыдущая работа с использованием традиционных OP9/ES и протоколов EB дифференциации показывает, что дополнительными факторами, может быть необходимо, например, гиперэкспрессия HoxB4 для того, чтобы получить долгосрочную заселения гемопоэтических стволовых клеток в пробирке. Дополнительные работы необходимо оценить, насколько mStrawberry отрицательным, отсортированных ES полученных населением содержат истинные гемопоэтических стволовых клеток.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим У. Ганапати для создания и тестирования mStrawberry OP9 клеточной линии. Кроме того, мы благодарим Г. Shafifor ей помощь в со-культуры. HP поддерживает общение с Национальный институт сердца, легких и крови институт (F31HL087714) (HP). Содержание этой работы является исключительной прерогативой автора и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального сердца, легких и крови институт или Национальных Институтов Здоровья (NIH). Цитометрии UCLA ядра потока фондом при поддержке НИЗ (CA-16 042 и АИ-28 697), Jonsson Cancer Center, Лос-Анджелесе со СПИДом института и школы UCLA Медицины.
OP-9 Cell Maintenance Medium Stock Components
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
FBS | Omega Scientific | FB01 | Pre-Tested |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-C I | 200nM |
Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 |
ES/OP-9 Cell Differentiation Medium Stock Components
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
FBS | Hyclone | SH30070 | Pre-Tested |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200mM |
PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-031-CV | |
Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 |