Clonogenic 분석 : 자기편 셀
Summary
생식 가능성을 평가하기위한 clonogenic 분석의 응용은 이상의 50 년 동안 설립되었습니다. 여기 자기편 세포와 clonogenic 분석을 수행하기위한 일반적인 절차를 보여줍니다.
Abstract
clonogenic (또는 콜로니 형성) 분석은 이상의 50 년 동안 설립되었습니다, 기술을 설명하는 원래의 논문은 1956 1이 공개되었습니다. 분리 방법을 문서화에서 최초 획기적인 연구 문화 1 X – 선 조사 포유 동물 (헬라) 세포에 대한 최초의 방사선 선량 – 반응 곡선을 생성. 제어 치료 세포와 같은 노출 등 다양한 트리 트먼트를받은 세포 사이에, 기본적으로 clonogenic 분석은 생식 생존의 차이 (50 이상 세포의 식민지를 형성하는 하나의 세포 즉 자손을 만들어 세포의 능력)의 평가를 수 방사선을 이온화하는 다양한 화합물 (예 : 세포 독성 대리인) 또는 그 밖의 경우에는 유전자 조작. 분석은 방사선 생물학에서 가장 널리 인정 기술되어 널리 다른 세포 라인의 방사선 감도를 평가에 사용되고 있습니다. 또한, clonogenic 분석은 일반적으로 방사선 수정 화합물의 효능을 모니터링하고 다른 세포 라인의 콜로니 형성 능력에 세포 독성 에이전트 및 다른 안티 암 치료제의 효과를 결정하는 데 사용됩니다. 자기편 세포 라인을 사용하는 전형적인 clonogenic 서바이벌 실험 식민지를 해결하고 얼룩 세 개의 서로 다른 구성 요소 1) 조직 문화 flasks의 세포 monolayer 치료, 2) 단일 세포 suspensions의 준비 및 배양 접시와 3 세포의 적절한 숫자를 도금)을 포함 관련 잠복기 다음, 이것은 세포 라인에 따라, 1-3 주에서 범위 수 있습니다. 여기서 우리는 영원히 인간 keratinocyte 세포 라인의 사용 (FEP – 1811) 2 자기편 세포 라인 clonogenic 분석을 수행하기위한 일반적인 절차를 보여줍니다. 또한, 우리의 목적은 방사선 세포의 노출 후 도금 효율성과 생존 분수의 계산을 포함 clonogenic의 assays의 일반적인 기능을 설명하고, 천연 항산화 제제의 사용과 방사선 반응의 수정을 예시하는 것입니다.
Protocol
Discussion
이 예제에서는 인간 FEP – 1811 keratinocytes 100 μg / ML CPF에 다양한 농도와 치료를했다, 데이터는 37에서 1 시간 20 μg / ML CPF ° C.에 대해 표시됩니다 다음 치료 세포는 137 고사 소스를 (; Nordion 국제, ON, 캐나다, 1.6 쥐 / 분 Gammacell 1000 엘리트 irradiator)를 사용하여 4 쥐와 함께 조사했다. 컨트롤에 대한 치료 및 약물 치료에만 100 세포는 각 배양 접시에있는 도금되었으며 요리 1000 세포가 조사 샘플 도…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원자력 과학 및 공학의 호주 연구소의 지원 인정받고 있습니다. TCK는 AINSE 보너스받는했다. Epigenomic 의학 연구소는 국민 건강과 호주의 의료 연구위원회 (566559)에 의해 지원됩니다. HR은 대학원 호주와 BakerIDI 밝은 점화 수상에 의해 지원됩니다. 이 작품은 바이오 메디컬 이미징 개발 회사 (CRC – 입찰가) 설립과 호주 정부의 협동 연구 센터 프로그램에 따라 지원을 위해 CRC에 의해 자금입니다. CO는 호주 대학원 보너스 및 CRC – 입찰 보조 장학금받는 사람입니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI-Chem | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
