Clonogênica Ensaio: células aderentes

Summary

A aplicabilidade do ensaio clonogênica na avaliação de viabilidade reprodutiva foi estabelecida há mais de 50 anos. Aqui demonstramos o procedimento geral para a realização do teste clonogênica com células aderentes.

Abstract

O clonogênica ensaio (ou formadoras de colônia) foi estabelecida há mais de 50 anos; o papel original que descreve a técnica foi publicada em 1956 ^1. Além de documentar o método, o estudo marco inicial gerada a curva de resposta primeira dose de radiação de raios-X de mamíferos irradiados (HeLa) células em cultura ^1. Basicamente, o ensaio clonogênica permite uma avaliação das diferenças de viabilidade reprodutiva (capacidade das células de produzir descendentes, ou seja, uma única célula para formar uma colônia de 50 ou mais células) entre as células controle não tratadas e as células que sofreram vários tratamentos, como a exposição a radiação ionizante, vários compostos químicos (por exemplo, agentes citotóxicos) ou em outros casos, a manipulação genética. O ensaio tornou-se a técnica mais aceita na biologia de radiação e tem sido amplamente utilizada para avaliar a sensibilidade à radiação de linhas de células diferentes. Além disso, o ensaio clonogênica é comumente usado para monitorar a eficácia de compostos de radiação modificando e para determinar os efeitos de agentes citotóxicos e outros anti-câncer terapêuticas sobre a capacidade formadora de colônia, em linhas de células diferentes. A experiência de sobrevivência típico clonogênica usando linhas de células aderentes envolve três componentes distintos, 1) o tratamento da monocamada de células em frascos de cultura de tecidos, 2) a preparação de suspensões de células individuais e revestimento de um número adequado de células em placas de petri e 3) de fixação e coloração colônias após um período de incubação relevante, que pode variar de 1-3 semanas, dependendo da linha celular. Aqui demonstramos o procedimento geral para a realização do teste clonogênica com linhas de células aderentes com o uso de uma linha celular imortalizada dos queratinócitos humanos (FEP-1811) ^2. Além disso, nossos objetivos são descrever características comuns de ensaios clonogênica incluindo o cálculo da eficiência revestimento e frações de sobrevivência após a exposição das células à radiação, e para exemplificar a modificação da radiação-resposta com o uso de uma formulação antioxidante natural.

Protocol

1. Cultura de células e Experimental Set-up Queratinócitos humanos são mantidos como monocamadas em 75 cm 2 frascos de cultura de tecidos contendo 15 mL de queratinócitos-SFM (K-SFM), médio (GIBCO, sem soro médio) suplementada com L-glutamina (2 mM), fator de crescimento epidérmico (5 ng / mL), extrato de hipófise bovina (40 mg / mL) e 20 mg / mL de gentamicina. As células são cultivadas em um 5% CO 2 umidificado ambiente a 37 ° C. Células são semeadas em 12 x 25 c…

Discussion

Neste exemplo humano FEP-1811 queratinócitos foram tratados com diferentes concentrações de até 100 mcg / mL CPF; dados são apresentados por 20 mcg / mL CPF para 1 hora a 37 ° C. Células após o tratamento foram irradiados com 4 Gy usando uma fonte de ¹³⁷ Cs (Gammacell irradiador 1000 Elite; Nordion International, ON, Canadá; 1,6 Gy / min). Para o controle não tratado e de drogas tratamentos apenas 100 células foram semeadas em cada placa de Petri e 1000 células por placa foram banhados para as amo…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Keratinocyte-serum free medium	Growth medium	Invitrogen	17005042	Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract.
Trypsin-EDTA		Invitrogen	15400-054	0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+.
Dulbecco’s modified essential medium	Growth medium	Invitrogen	11885-084	Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA.
0.09% Saline	Solution			Used to wash colonies.
10% Neutral buffered formalin solution	Solution	Sigma-Aldrich	HT501128	~4% formaldehyde; used to fix colonies.
Crystal violet	Powder	SPI-Chem	02577-MB	0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies.
Gammacell 1000 elite irradiator		Nordion International Inc.
Petri dishes	60 x 15 mm	Falcon	353002
Haemocytometer		Hawksley; Medical and Laboratory Equipment	AC1000
Cloning box				Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation.
Stereomicroscope	Type 102	Nikon		Used to count colonies consisting of >50 cells.