Simple reconstruction microscopie électronique de particules du complexe Exosome Utilisation de la méthode aléatoire Tilt conique
Summary
Cet article décrit une méthode standard pour obtenir un en trois dimensions (3D) la reconstruction des macromolécules biologiques en utilisant la microscopie électronique négative coloration (EM). Dans ce protocole, nous expliquons comment obtenir la structure 3D du complexe Saccharomyces cerevisiae exosomes à moyenne résolution utilisant la méthode aléatoire coniques de reconstruction d'inclinaison (ECR).
Abstract
Simple microscopie électronique de particules (EM) la reconstruction est récemment devenu un outil populaire pour obtenir les trois dimensions (3D) la structure des complexes macromoléculaires grande. Comparé à cristallographie aux rayons X, il a quelques avantages uniques. Tout d'abord, seule la reconstruction de particules EM n'a pas besoin de cristalliser l'échantillon de protéine, qui est le goulot d'étranglement dans cristallographie aux rayons X, notamment pour les grands complexes macromoléculaires. Deuxièmement, il n'a pas besoin de grandes quantités d'échantillons de protéines. Comparativement aux milligrammes de protéines nécessaires à la cristallisation, la seule particule EM besoins de reconstruction que plusieurs micro-litres de solution de protéine à la nano-concentrations molaires, en utilisant la méthode de coloration négative EM. Cependant, malgré un peu d'assemblages macromoléculaires à symétrie élevée, seule particule EM est limité à une résolution relativement faible (inférieure à une résolution de 1 nm) pour de nombreux spécimens en particulier ceux sans symétrie. Cette technique est également limitée par la taille des molécules à l'étude, soit 100 kDa pour les spécimens colorés négativement et 300 kDa pour frozen-hydraté spécimens en général.
Pour un nouvel échantillon de structure inconnue, on utilise généralement une solution de métal lourd à intégrer les molécules par coloration négative. L'échantillon est ensuite examiné au microscope électronique à transmission à prendre en deux dimensions (2D) micrographies des molécules. Idéalement, les molécules de protéines ont une structure homogène 3D mais présentent des orientations différentes dans les micrographies. Ces micrographies sont numérisées et traitées dans les ordinateurs comme des «particules uniques". En utilisant deux dimensions d'alignement et les techniques de classification, les molécules homogènes dans les mêmes vues sont regroupées en classes. Leurs moyennes améliorer le signal de formes 2D de la molécule. Après nous assignons les particules dans le bon sens relatif (angles d'Euler), nous serons en mesure de reconstruire les images 2D de particules dans un volume virtuel en 3D.
Dans la reconstruction de particules 3D unique, une étape essentielle est d'assigner correctement l'orientation correcte de chaque particule unique. Il existe plusieurs méthodes pour attribuer le point de vue pour chaque particule, dont la reconstitution angulaire 1 et aléatoire d'inclinaison conique (ECR) la méthode 2. Dans ce protocole, nous décrivons notre pratique à obtenir la reconstruction 3D du complexe de la levure à l'aide exosomes coloration négative EM et ECR. Il convient de noter que notre protocole de la microscopie électronique et de traitement de l'image suit le principe de base du RCT, mais n'est pas la seule façon d'exécuter la méthode. Nous décrivons d'abord comment intégrer l'échantillon de protéine dans une couche d'uranyle-Formiate d'une épaisseur comparable à la taille des protéines, en utilisant une grille de carbone troué recouvert d'une couche de film continu de carbone mince. Puis l'échantillon est inséré dans un microscope électronique à transmission à recueillir Untilted (0 degré) et incliné (55 degrés) paires de micrographies qui sera utilisé plus tard pour le traitement et l'obtention d'un premier modèle 3D de la exosomes levure. À cette fin, nous effectuons RCT et ensuite raffiner le modèle initial en 3D en utilisant la projection correspondant 3 la méthode de raffinement.
Protocol
Discussion
Dans cet article nous présentons un protocole détaillé de préparation des échantillons et les trois dimensions de reconstruction du complexe exosomes utilisant la microscopie électronique négative coloration. En utilisant cette méthode, nous avons obtenu la reconstruction 3D utilisant la méthode aléatoire d'inclinaison conique sans aucune connaissance préalable de la structure. Aléatoire la méthode d'inclinaison conique n'est pas nécessairement un échantillon homogène, mais l'étape de pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire à Nogales UC-Berkeley en aidant à établir des protocoles initiaux et les membres de Wang laboratoire à l'Université de Yale dans leur aider à établir les protocoles plein. Nous reconnaissons aussi le personnel en cryo-EM installations et centre de calcul haute performance à l'école de médecine de Yale pour leur soutien. HW Smith est une famille de boursiers.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyvinyl Formal Resin | Electron Microscopy Science | 63450-15-7 | ||
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Science | 22451 | ||
| Superfrost Microscope Slides | Thermo Scientist | 4951F-001 | ||
| 400 mesh grid regular | SPI Supplies | 3040C | ||
| Carbon coater Auto 306 | Edwards | |||
| Tecnai-12 Electron Microscope | FEI | |||
| Glow Discharger | BAL-TEC | Sputter Coater SCD 005 |
References
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