Single Particle Electron Microscopy Reconstructie van de Exosome Complex Met behulp van de Random conische Tilt Methode
Summary
Dit artikel beschrijft een standaard methode om een drie-dimensionale (3D) reconstructie van biologische macromoleculen met behulp van negatieve kleuring van elektronenmicroscopie (EM) te krijgen. In dit protocol leggen we uit hoe u de 3D-structuur van de Saccharomyces cerevisiae exosome complex krijgen op medium resolutie met behulp van de random conische kantel reconstructie methode (RCT).
Abstract
Enkel deeltje elektronenmicroscopie (EM) reconstructie heeft onlangs uitgegroeid tot een populaire tool om de drie-dimensionale (3D) structuur van grote macromoleculaire complexen te krijgen. Vergeleken met X-ray kristallografie, heeft het een aantal unieke voordelen. Ten eerste, enkel deeltje EM reconstructie niet nodig om het eiwit monster, dat is het knelpunt in de X-ray kristallografie kristalliseren, vooral bij grote macromoleculaire complexen. Ten tweede is het niet nodig grote hoeveelheden eiwit monsters. Vergeleken met milligram van eiwitten die noodzakelijk zijn voor kristallisatie, enkel deeltje EM wederopbouw slechts enkele micro-liters van de eiwit-oplossing bij nano-molaire concentraties, het gebruik van de negatieve kleuring EM-methode. Ondanks een paar macromoleculaire assemblages met een hoge symmetrie, enkel deeltje EM is beperkt tot relatief lage resolutie (lager dan 1 nm resolutie) voor vele exemplaren in het bijzonder diegenen zonder symmetrie. Deze techniek wordt ook beperkt door de grootte van de moleculen onder studie, dat wil zeggen 100 kDa voor negatief gekleurde exemplaren en 300 kDa voor bevroren gehydrateerd exemplaren in het algemeen.
Voor een nieuwe steekproef van onbekende structuur, we meestal gebruik van een heavy metal oplossing om de moleculen insluiten door negatieve kleuring. Het monster wordt vervolgens onderzocht in een transmissie-elektronenmicroscoop om tweedimensionale (2D) microfoto van de moleculen te nemen. In het ideale geval de eiwitmoleculen hebben een homogene 3D-structuur, maar vertonen verschillende oriëntaties in de microfoto. Deze microfoto zijn gedigitaliseerd en verwerkt in computers als "single deeltjes". Met behulp van twee-dimensionale alignment en classificatie technieken, homogeen zijn moleculen in dezelfde standpunten geclusterd in klassen. Hun gemiddelde op verbetering van het signaal van 2D het molecuul vormen. Na wijzen we de deeltjes met de juiste relatieve oriëntatie (Euler hoeken), zullen we in staat zijn om de 2D-deeltje beelden te reconstrueren in een virtuele 3D-volume.
In single deeltje 3D-reconstructie, een essentiële stap is het correct toewijzen van de juiste oriëntatie van elk afzonderlijk deeltje. Er zijn verschillende methoden om de weergave van elk deeltje toe te wijzen, waaronder de hoekige reconstitutie 1 en willekeurige conische tilt (RCT) methode 2. In dit protocol beschrijven we onze praktijk in het krijgen van de 3D-reconstructie van gist exosome complex met behulp van negatieve kleuring EM en RCT. Opgemerkt moet worden dat ons protocol van elektronen microscopie en beeldverwerking het basisprincipe van RCT volgt, maar is niet de enige manier om de methode uit te voeren. We beschrijven eerst hoe het eiwit monster in te bedden in een laag van Uranyl-Formate met een dikte vergelijkbaar met de grootte van eiwit, met behulp van een essen carbon rooster bedekt met een laag van continue dunne koolstof film. Dan het monster wordt in een transmissie-elektronenmicroscoop te verzamelen Untilted (0 graden) en gekanteld (55 graden) paren van microfoto die later zullen worden gebruikt voor de verwerking en het verkrijgen van een eerste 3D-model van de gist exosome. Daartoe voeren we RCT en verfijnen van de eerste 3D-model met behulp van de projectie-matching verfijning methode 3.
Protocol
Discussion
In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol van monstervoorbereiding en driedimensionale reconstructie van de exosome complex met behulp van negatieve kleuring elektronenmicroscopie. Met behulp van deze methode, kregen we de 3D-reconstructie met behulp van willekeurige conische kantel methode zonder enige voorkennis van de structuur. Random conische tilt methode vereist niet noodzakelijk een homogeen monster, maar de volgende projectie matching verfijning stap zou een homogeen monster nodig hebben om een ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de leden van Nogales lab bedanken UC Berkeley-in het helpen van vaststelling van de eerste protocollen en de leden van Wang lab aan de Yale University in hun hulp om de volledige protocollen vast te stellen. We erkennen ook dat het personeel in de cryo-EM-faciliteit en High-Performance Computation Center aan de Yale School of Medicine voor hun steun. HW is een Smith Family opdrachtnemer.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyvinyl Formal Resin | Electron Microscopy Science | 63450-15-7 | ||
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Science | 22451 | ||
| Superfrost Microscope Slides | Thermo Scientist | 4951F-001 | ||
| 400 mesh grid regular | SPI Supplies | 3040C | ||
| Carbon coater Auto 306 | Edwards | |||
| Tecnai-12 Electron Microscope | FEI | |||
| Glow Discharger | BAL-TEC | Sputter Coater SCD 005 |
References
- van Heel, M. Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction. Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).
- Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series. J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).
- Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles. Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative staining and image classification – powerful tools in modern electron microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
- Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
- Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).
- Heel, M. v. a. n., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. UCSF Chimera–a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).
- Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3′ end processing. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).
- Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp. Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).
- Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation. J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).
