Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen
Summary
De huidige video toont een methode die gebruik maakt van de combinatie van elektroporatie en confocale microscopie te leven imaging op individuele neurale stamcellen uit te voeren in de zich ontwikkelende zebravis voorhersenen.<em> In vivo</em> Analyse van de ontwikkeling van de voorhersenen neurale stamcellen op een klonale niveau kan worden bereikt op deze manier.
Abstract
Precieze patronen van verdeeldheid, migratie en differentiatie van neurale progenitorcellen zijn cruciaal voor een goede ontwikkeling van de hersenen en de functie 1,2. Om te begrijpen van het gedrag van neurale progenitor cellen in het complex in vivo omgeving, is het time-lapse live-imaging van neurale stamcellen in een intacte hersenen kritisch nodig. In deze video maken we gebruik van de unieke kenmerken van de zebravis embryo's naar de ontwikkeling van de voorhersenen neurale progenitor cellen in vivo te visualiseren. We maken gebruik van elektroporatie van genetisch en dun label individuele neurale progenitor cellen. Kortom, DNA-constructen die coderen voor fluorescerende merkers werden geïnjecteerd in de voorhersenen ventrikel van 22 uur na de bevruchting (HPF) zebravis embryo's en elektrische pulsen werden onmiddellijk afgeleverd. Zes uur later werden de zebravis embryo's geëlektroporeerd gemonteerd met een laag smeltpunt agarose in glazen bodem cultuur gerechten. Fluorescent gelabelde neurale progenitor cellen werden vervolgens belicht voor 36 uur met vaste intervallen onder een confocale microscoop met behulp van water te dompelen objectief. De huidige methode biedt een manier om inzicht te krijgen in de in vivo ontwikkeling van voorhersenen neurale progenitor cellen en kan worden toegepast op andere delen van het centrale zenuwstelsel van de zebravis embryo.
Protocol
Discussion
In deze video tonen we een methode voor time-lapse live-beeldvorming van neurale stamcellen op een klonale niveau in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen. We testten en gewijzigd de elektroporatie bestaande protocollen 4-6 om genetisch en fluorescent label individuele neurale progenitor cellen. Een afstamming boom bestaat uit klonaal verwante nakomelingen cellen kunnen worden vastgesteld, omdat slechts een paar cellen werden dun gemerkt met een relatief lage spanning van elektroporatie. In aanvulling …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door theNIH grantNS042626. We danken Kurt Thorn en UCSF Nikon Imaging centrum voor hulp bij beeldvorming.
References
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
- G#246;tz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).
- Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos. Methods. 39, 207-211 (2006).
- Hendricks, M., Jesuthasan, S. Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development. Neural. Dev. 2, 6-6 (2007).
- Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae. Methods Mol. Biol. 546, 145-151 (2009).
- Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration. Genesis. 32, 27-31 (2002).
