שיטה יעילה להשגת מטוהרים שברים meiotic קיימא מהעכבר testis מתואר, המשלבת תא מעודן דיסוציאציה פרוטוקול עם מיון פלורסנט התא הפעיל (FACS). שיטה זו מנצלת את ההבדלים בתוכן דנ"א צפיפות גרעינית של שברים meiotic בדידים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
אופי הטרוגני של סוגי תאים ב testis ואת היעדרם של מודלים תרבות meiotic תא היו מכשולים משמעותיים כדי ללמוד את התוכניות התמיינות ייחודית כי הם לידי ביטוי במהלך המיוזה. שתי השיטות העיקריות פותחו כדי לטהר, בדרגות שונות, שברים meiotic שונים למבוגרים והן בבעלי חיים מפותחים: elutriation או Staput (שקיעה) באמצעות BSA ו / או percoll הדרגתיים. שתי שיטות אלה מסתמכים על גודל התא וצפיפות להפריד תאים meiotic 1-5. בסך הכל, למעט אוכלוסיות תאים ספורים 6, פרוטוקולים אלה אינם מצליחים להניב טוהר מספקת של אוכלוסיות רבות תא meiotic הדרושים ניתוחים מולקולריים מפורט. יתר על כן, עם שיטות כאלה בדרך כלל סוג אחד של תאים meiotic יכול להיות מטוהרים בזמן נתון, אשר מוסיפה רמה נוספת של מורכבות לגבי שחזור והומוגניות כאשר משווים דגימות תאים meiotic.
כאן אנו מתארים שיטה מעודן המאפשר אחד כדי לחזות בקלות, לזהות ולטהר תאים meiotic, החל בתאי הנבט כדי spermatids עגול, באמצעות FACS בשילוב עם מכתים 33342 Hoechst 7,8. שיטה זו מספקת תמונה כוללת של תהליך meiotic כולו מאפשר מאוד לטהר את התאים קיימא משלב ביותר של המיוזה. תאים אלה מטוהרים אז יכול להיות ניתח בפירוט את השינויים המולקולריים שמלווים התקדמות דרך המיוזה, שינויים בביטוי הגנים למשל 9,10 ואת הדינמיקה של תפוסה הנוקלאוזום על נקודות חמות של רקומבינציה meiotic 11.
פרוטוקול
פרוטוקול זה ניתן להפריד בין שני שלבים עיקריים: (1) ניתוק ו Hoechst 33342 מכתים של תאים עכבר testis ואחריו, במידת הצורך, (2) FACS מיון של שברים meiotic הרלוונטיים, כולל כל שלבי המיוזה, מתאי נבט אל בסיבוב spermatids. לאחר שנאספו, אוכלוסיות אלה meiotic מועשר יכול לשמש עבור מגוון רחב של ניתוח. פרוטוקול זה מתאר את ניתוק של אחד testis מבוגר; כרכים ניתן להתאים בהתאם לנערים או האשכים נוספים.
1. Testis דיסוציאציה
- מקום אחד testis decapsulated בצינור 15 מ"ל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול המוצג לעיל מאפשר בו זמנית לטהר מעכברים זכר בוגר את כל טווח של תאים בשלב meiotic עם הטוהר גבוהה מאוד, ומאפשר לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של התהליך הבסיסי הזה. תאים מטוהרים יכול לשמש עבור יישומים רבים, החל 9,10 מיצוי RNA, מיפוי הנוקלאוזום 11, גילוי מולקולה רקומביננטי, מנתח חלבון, ועוד רבים. עם זאת, שיטות זיהוי צריך להיות מותאם לכמות התאים meiotic מטוהרים. יתר על כן, עם שחזור הגבוהה של שיטה זו, ניתן מיני בריכה מרובים עצמאית של שבר אותו ביצע בימים שונים כד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
פרויקט זה מומן בחלקו על ידי כספי ממדינת פלורידה סקריפס ומספרי הפרס R01GM085079 ו R21HD061304 מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית לבין המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם, בהתאמה. זהו כתב היד מספר 20917 של מכון המחקר סקריפס.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Collagenase Type-1 | Worthington Biochemical | CLSS1 | המס עד לריכוז 12,000U/ml ב-GBSS, אחסון ב-4°C |
| Trypsin | Worthington Biochemical | TRL3 | המס ב-1mM HCl עד לריכוז 50mg/ml, אחסון ב-4°C |
| H–chst 33342 | Acros Organics | 230001000 | תמיסה רוויה (10mg/ml ב-DMSO, אחסון ב-4°C |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | המס במים/50% glycerol עד לריכוז 1mg/ml, אחסון ב-20-°C |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| פיפטה להעברה בגודל 6" | Fisher Scientific | 137119D |
מקורות
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
