Aqui nós mostramos como usar Assay Proximidade Ligadura (PLA), com uma combinação de anticorpos para visualizar proteínas morfogenéticas ósseas (BMP) de sinalização em células fixas. Esta técnica permitiu-nos a seguir o acúmulo nuclear de BMP activada endógena efetoras complexos e quantificar os seus níveis ao longo do tempo sob BMP4 estimulação.
BMPs são responsáveis por uma grande variedade de efeitos no desenvolvimento e biológicas. Receptores de BMP ativar (fosforilar) o Smad1/5/8 efetores, que então, formam um complexo com Smad4 e translocar para o núcleo onde funcionam como fatores de transcrição para iniciar BMP efeitos específicos a jusante 1. Tradicionais imuno-fluorescência técnicas com anticorpos contra fosfo Smad-peptídeos apresentam baixa sensibilidade fundo, alta e oferecer quantificação bruta como eles dependem da intensidade do sinal de anticorpos particularmente se este é fotossensível fluorescente. Além disso, fosfo-Smads não podem ser todos em um complexo com Smad4 e engajados na transcrição ativa.
In situ PLA é uma tecnologia capaz de detectar as interações de proteínas com alta especificidade e sensibilidade 2-4. Esta nova tecnologia de reconhecimento de casais de anticorpos com a amplificação de DNA substituto da proteína. Ele gera um sinal, localizada em uma discreta forma de spots revelando a posição exata do evento de reconhecimento. O número de sinais podem ser contados e comparados proporcionando uma medição. Nós aplicamos em PLA situ, utilizando o kit Duolink, com uma combinação de anticorpos que permite a detecção do effectors BMP e sinalização phospho-Smad1/5/8 Smad4 apenas quando estes estão em proximidade ou seja, em um complexo, que ocorre apenas com a sinalização ativação. Isto permitiu, pela primeira vez, a visualização e medição de BMP endógenos de sinalização com alta especificidade e sensibilidade em um experimento de curso de tempo sob estímulo BMP4.
A visualização de complexos de proteínas in situ está em grande demanda, especialmente para estudos na sinalização onde a interação de proteínas e modificação de proteínas são os meios que as células usam para o envio de um sinal de sua superfície para o núcleo. Não foi possível visualizar e quantificar complexos entre duas proteínas endógenas in situ por imunofluorescência antes. Co-localização de anticorpos apresenta baixa resolução e não pode ser usado para visualizar verdadeira interação. PLA é uma nova técnica que os pesquisadores começaram a usar em diferentes sistemas com grande sucesso 6, 7. Aqui, demonstramos como usar PLA não só de visualizar, mas também para quantificar complexos endógenos entre effectors Smad ativada a jusante de estimulação BMP ao longo do tempo. Nós usamos células do tecido diferente de cultura, incluindo Neuro2a e contou com anticorpos comerciais levantadas em diferentes espécies (rato e coelho-Smad4 aP-Smad1/5/8) para alcançar este (fig. 1). Este método permitiu, pela primeira vez, para ver a ativação de BMP-efetoras complexos ao longo do tempo e não apenas a presença do Smad1/5/8 fosforilada, que não podem ser todos envolvidos em complexos ativos com Smad4. Nós contamos os sinais (fig. 1F) e comparou a medida com a quantificação obtida immunoblot das mesmas células 8 (figura 1G). Concluiu-se que o número de pontos fornecem uma medida exata comparativa dos níveis de sinalização ao longo do tempo. A técnica também foi aplicado em linhas de outra célula (HEK293T e Cos7) com resultados semelhantes (dados não mostrados).
O princípio da tecnologia é baseada em duas sondas exclusivas fornecidas com o kit Duolink. Cada sonda PLA consiste de um anticorpo secundário ligado a um oligonucleotídeo sintético única, que atua como repórter. A proximidade das sondas de DNA permite a ligadura no local exato onde essas sondas encontram-se em proximidade. A distância do oligonucleotides, que permite a hibridização de DNA e ligadura é pequeno (40nm <) e, portanto, apenas as proteínas que interagem pode permitir ligadura. O DNA ligado pode então ser amplificado e detectado com hibridização de oligonucleotídeos rotulado da seqüência amplificada. A amplificação é específico, uma vez que depende de princípios hibridização DNA-DNA e também fornece alta sensibilidade como o DNA é amplificado ligado várias vezes, resultando em melhoria do evento ligadura inicial. O DNA amplificado é detectado por hibridização com oligonucleotídeos marcados e produz um local visível e bastante grande. Como as manchas podem ser contados, o sinal PLA fornece não só a informação exata espacial (o local dos eventos de interação), mas também uma forma objetiva de quantificar esses eventos 2-4.
Outras técnicas que são empregadas para a detecção de interações proteína incluem co-imunoprecipitação, imunofluorescência e transferência de energia fluorescente ressonância (FRET). Co-imunoprecipitação ensaios são amplamente utilizados permitindo o isolamento de complexos de proteínas. O método é acompanhado por immunoblotting o que significa que as proteínas devem ser expressas em níveis relativamente elevados, a fim de ser detectado. Problemas de fundo elevado ou ligação não específica de algumas proteínas que as contas são por vezes difíceis de superar, em co-imunoprecipitação. Além disso, co-imunoprecipitação ensaios permitem a detecção de proteínas que pode ser parte de um complexo de proteínas, mas não pode distinguir aqueles que estão muito próximas fisicamente interagindo uns com os outros. Além disso, co-immunoprecipitations não pode fornecer quantificação na resolução única célula ou informações sobre a localização dos complexos de proteína na célula. Detecção de co-existência de complexos de proteínas em uma célula ou um compartimento celular por imunofluorescência é baseado na sobreposição de sinais difusos e, portanto, tem baixa resolução espacial e não pode fornecer informações precisas sobre as interações proteína. Quantificação do sinal de imunofluorescência pode ser feito por estimativa visual apenas se a diferença é várias vezes, e não pode ser exato ou mensuráveis como os pontos PLA. FRET permite a visualização de complexos de proteínas em células vivas e supera a necessidade de anticorpos e da exposição do epítopo. No entanto, FRET geralmente depende da superexpressão de proteínas fundidas artificial, que pode não refletir a complexos de proteína endógena como no PLA.
Condições de bloqueio no protocolo de PLA são críticos como agregação de anticorpos pode ocorrer e aumentar o fundo. Alternativas condições de bloqueio pode ser encontrado em folhas de produtos de anticorpos. Controles apropriados com omissão do anticorpo primário e secundário fornecer informações sobre o que pode ter dado errado e eles precisam ser sempre incluído. É importante para a tela anticorpos diferentes que vai dar o mínimo de fundo quando eles são usados sozinhos e o melhor sinal quando estão juntos. Fixação de cells é crítica como sobre a fixação de complexos de proteínas pode causar a total desnaturar e degradar, enquanto que a fixação insuficiente pode levar à perda de complexos de proteínas durante as etapas do procedimento. Isto pode ser controlado através da redução da concentração do fixador a 3% ou limitando o tempo de fixação. No entanto, a fixação depende também se os anticorpos primários reconhecer proteínas desnaturadas ou não. Como a técnica de PLA é muito sensível, cuidados especiais são necessários para manter os tempos de incubação e as condições micro iguais entre diferentes amostras.
As amostras não devem ser deixadas para secar em qualquer caso, antes da etapa final. A secagem das amostras pode levar a aumento de fundo. A remoção completa da solução de bloqueio também é fundamental para evitar a fundo. Os buffers de lavagem deve sempre estar à temperatura ambiente antes do uso, como baixa temperatura retarda as reações enzimáticas. Para solucionar o problema, consulte o manual do Kit.
É útil usar manchas para determinar a localização sub-celular do sinal de PLA (por exemplo, DAPI, actina etc). Aqui nós temos utilizado DAPI (no meio de montagem) para manchar os núcleos. PLA é compatível com o uso de imunofluorescência com anticorpos para determinar o tipo de célula ou compartimento celular (não mostrado aqui). Quantificação exata pode ser feito através da contagem de sinais eo uso de software específico (Image Tool Duolink, Olink Biosience).
Em conclusão, demonstramos como usar no PLA situ, utilizando o kit para detectar Duolink BMP sinalização em células fixas e apresentou as suas vantagens: fácil de usar, altamente sensível, sem fundo, e uma capacidade única para quantificar ativos de sinalização BMP in situ.
A limitação da aplicação desta técnica para estudar as interações proteína diferente depende da disponibilidade e qualidade dos anticorpos primários que reconhecem as proteínas sob investigação.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa é financiada pelo MRC e as subvenções BBSRC. Agradecemos a Agata Zieba e Katerina Pardalis no laboratório de Ulf Landegren, Uppsala University para ajudar com a criação da técnica e conselhos úteis. Olink Biosience para ajuda técnica e apresentação.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
GMEM | Invitrogen | 21710025 | ||
DMEM | Invitrogen | 21063029 | ||
FBS | AutogenBioclear | 7.01 | ||
Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11149068 | ||
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | ||
Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-054 | ||
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | ||
16-well chamber slides | Lab-Tek | 178599 | ||
Polysine | VWR | 631-0107 | ||
Cover glass | VWR | 631-0138 | ||
a-pSmad1/5/8 | Cell Signaling | 9511 | ||
a-Smad4 (B8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7966 | ||
Dorsomorphin | Merck | 171260-10MG | ||
Recombinant Mouse BMP-4 | R&D | 5020-BP-010 | ||
PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | ||
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | ||
Tween-20 | Promega | H5151 | ||
Duolink II Detection Reagents (Orange) | OLINK | 92007-0100 | ||
Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS | Olink Bioscience | 92004-0100 | ||
Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS | Olink Bioscience | 92002-0100 | ||
Duolink II Mounting Medium with DAPI | Olink Bioscience | 82040-0005 | ||
Duolink II Wash Buffers Fluorescence | Olink Bioscience | 82049 |