Här visar vi hur du använder analys Närhet Ligation (PLA), med en kombination av antikroppar mot visualisera Protein Benmorfogenetiska (BMP) signalering i fasta celler. Denna teknik gjorde att vi kunde följa den nukleära ackumulation av endogena BMP aktiveras effektormedierad komplex och kvantifiera deras nivåer över tiden under BMP4 stimulering.
BMP är ansvariga för ett stort antal utvecklings-och biologiska effekter. BMP-receptorerna aktiverar (fosforylera) den Smad1/5/8 effektenheter som sedan bildar ett komplex med Smad4 och translocate till kärnan där de fungerar som transkriptionsfaktorer att inleda BMP specifika nedströms effekter 1. Traditionella immuno-fluorescens tekniker med antikroppar mot fosfor-Smad peptider uppvisar låg känslighet, hög bakgrund och erbjuda grov kvantifiering eftersom de bygger på intensiteten av antikroppen signalen särskilt om det är ljuskänslig lysrör. Dessutom kan fosfor Smads inte alla vara i komplex med Smad4 och engagerade i aktiv transkription.
In situ PLA är en teknik kan upptäcka protein interaktioner med hög specificitet och känslighet 2-4. Denna nya teknik par antikroppar erkännande med förstärkningen av DNA-surrogat av proteinet. Det genererar en lokaliserad, diskret signal i form av fläckar avslöja den exakta positionen för erkännande händelsen. Antalet signaler som kan räknas och jämföras ger en mätning. Vi appliceras på plats PLA, med hjälp av Duolink kit, med en kombination av antikroppar som gör att detektion av BMP signalering effektenheter phospho-Smad1/5/8 och Smad4 endast när dessa är i närheten, dvs i en komplex, som inträffar bara med signalering aktivering. Detta gjorde det möjligt för första gången, visualisering och mätning av endogena BMP signalering med hög specificitet och känslighet under en tidsperiod försök enligt BMP4 stimulering.
Visualisering av proteinkomplex på plats är stor efterfrågan, särskilt för studier i signalering där proteininteraktioner och protein modifiering är de medel som cellerna använder för att skicka en signal från sin yta till kärnan. Det har inte varit möjligt att visualisera och kvantifiera komplex mellan två kroppsegna proteiner in situ med immunofluorescens förut. Co-lokalisering av antikroppar visar låg upplösning och kan inte användas för att visualisera sann interaktion. PLA är en ny teknik som forskarna har börjat använda i olika system med stor framgång 6, 7. Här visar vi hur du använder PLA inte bara för att visualisera, men också att kvantifiera endogen komplex mellan Smad effektenheter aktiveras nedströms BMP stimulering över tiden. Vi använde olika celler vävnadskultur inklusive Neuro2a och förlitade sig på kommersiella antikroppar upp i olika arter (mus a-Smad4 och kanin aP-Smad1/5/8) för att uppnå detta (fig 1). Denna metod gjorde att vi, för första gången, för att se aktivering av BMP effektormedierad komplex över tiden och inte bara närvaron av fosforyleras Smad1/5/8, som inte får alla vara engagerade i aktiv komplex med Smad4. Vi räknade signalerna (figur 1F) och jämfört mätning med en kvantifiering från immunoblot av samma celler 8 (figur 1G). Vi drog slutsatsen att antalet platser ger en korrekt jämförande mätning av signalering nivåer över tiden. Tekniken tillämpades också på andra cellinjer (HEK293T och Cos7) med liknande resultat (data visas inte).
Principen för tekniken bygger på två unika sonder som medföljer Duolink satsen. Varje PLA sond består av en sekundär antikropp kopplad till en unik syntetisk oligonukleotid, som fungerar som en reporter. Närheten till sonderna kan DNA ligation på den exakta platsen där dessa sonder bifogas i närheten. Avståndet mellan oligonukleotider, som tillåter DNA-hybridisering och ligatur är liten (<40nm) och kan därför endast proteiner som interagerar tillåter ligatur. Det knyts ihop DNA kan sedan amplifieras och påvisas med hybridisering av märkta oligonukleotider av det förstärkta sekvensen. Den förstärkningen är specifikt eftersom det beror på DNA-DNA-hybridisering principer och ger också hög känslighet som knyts ihop DNA förstärks flera gånger, vilket resulterar i förbättring av den ursprungliga ligering händelsen. Det förstärkta DNA detekteras genom hybridisering med märkta oligonukleotider och ger en synlig och ganska stor plats. Som fläckarna kan räknas ger PLA-signalen inte bara exakt geografisk information (platsen för interaktionen händelser), men också ett objektivt sätt att kvantifiera dessa händelser 2-4.
Andra tekniker som används för detektion av proteininteraktioner omfattar kooperativa immunoprecipitation, immunofluoresence och fluorescerande Resonance Energy Transfer (FRET). Co-immunoprecipitation analyser används i stor utsträckning gör det möjligt isolering av proteinkomplex. Metoden åtföljs av immunoblotting vilket innebär att proteinerna måste uttryckas på relativt höga nivåer för att kunna upptäckas. Problem med hög bakgrund eller icke-specifik bindning av vissa proteiner för att kulorna är ibland svåra att övervinna i samarbete immunoprecipitation. Dessutom, co-immunoprecipitation analyser möjliggör detektion av proteiner som kan vara del av ett protein komplex, men kan inte urskilja de som är mycket nära att interagera fysiskt med varandra. Dessutom kan samarbetet immunoprecipitations tillhandahåller inte kvantifiering i en enda cell upplösning eller information om lokalisering av protein komplex i cellen. Upptäckt av samexistens av protein komplex i en cell eller en cell facket genom immunofluoresence bygger på överlappningen av spridda signaler och därför har låg spatial upplösning och inte kan ge korrekt information om proteininteraktioner. Kvantifiering av immunofluoresence signalen kan göras genom visuell bedömning endast om skillnaden är flera gånger, och kan inte vara korrekt eller mätbara som PLA fläckar. FRET tillåter visualisering av proteinkomplex i levande celler och övervinner behovet av antikroppar och exponeringen av epitop. Beror dock FRET oftast på överuttryck av artificiella smält proteiner, som kanske inte återspeglar det kroppsegna proteinet komplex som i PLA.
Blockering förhållandena i PLA-protokollet är kritiska eftersom antikroppar aggregering kan uppstå och öka bakgrunden. Alternativa blockering villkor finns i ark antikroppen. Lämpliga kontroller med primär och sekundär antikropp underlåtenhet att informera om vad som kan ha gått fel och de måste alltid ingå. Det är viktigt att skärmen olika antikroppar som ger minst bakgrunden när de används ensamma och den bästa signalen när de är tillsammans. Fixering av CELLS är kritisk över uppgjorda kan orsaka proteinkomplex att helt urvattnat och förnedra, medan otillräcklig fixering kan leda till förlust av protein komplex under stegen i förfarandet. Detta kan kontrolleras genom att sänka koncentrationen av fixativ till 3% eller genom att begränsa fixering tiden. Beror dock fixering också på om de primära antikropparna känner igen denatureras proteiner eller inte. Eftersom PLA tekniken är mycket känslig, är särskild försiktighet behövs för att hålla inkubationstiderna och mikro villkor lika mellan olika prover.
Proverna bör inte lämnas att torka i alla fall innan det sista steget. Torkningen av proverna kan leda till ökade bakgrund. Fullständig borttagning av den blockerande lösningen är också viktigt för att undvika bakgrund. Det tvätta buffertar ska alltid föras till rumstemperatur före användning, så låg temperatur saktar den enzymatiska reaktioner. För ytterligare felsökning läsa i manualen i Kit.
Det är bra att använda fläckar att fastställa den sub-cellulära lokalisering av PLA signal (t.ex. DAPI, aktin etc). Här har vi använt DAPI (i monteringsmedium) att färga kärnor. PLA är kompatibel med användningen av immunofluorescens med antikroppar för att bestämma celltyp eller cellulära fack (visas inte här). Exakt kvantifiering kan göras genom att räkna de signaler och användningen av särskild mjukvara (Duolink Image Tool, Olink Biosience).
Sammanfattningsvis har vi visat hur man använder in situ PLA, med hjälp av Duolink kit för att upptäcka BMP signalering i fasta celler och presenterade sina fördelar: lätt att använda, mycket känslig, ingen bakgrund och en unik förmåga att kvantifiera aktiva BMP signalering på plats.
Begränsningen av tillämpningen av denna teknik för att studera olika proteininteraktioner beroende av tillgången och kvaliteten på den primära antikroppar som känner igen de proteiner som undersöks.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning finansieras av MRC och BBSRC bidrag. Vi tackar Agata Zieba och Katerina pardalis i Ulf Landegren labb, Uppsala universitet för att hjälpa till med att inrätta den teknik och användbara råd. Olink Biosience för teknisk hjälp och presentationen.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
GMEM | Invitrogen | 21710025 | ||
DMEM | Invitrogen | 21063029 | ||
FBS | AutogenBioclear | 7.01 | ||
Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11149068 | ||
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | ||
Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-054 | ||
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | ||
16-well chamber slides | Lab-Tek | 178599 | ||
Polysine | VWR | 631-0107 | ||
Cover glass | VWR | 631-0138 | ||
a-pSmad1/5/8 | Cell Signaling | 9511 | ||
a-Smad4 (B8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7966 | ||
Dorsomorphin | Merck | 171260-10MG | ||
Recombinant Mouse BMP-4 | R&D | 5020-BP-010 | ||
PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | ||
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | ||
Tween-20 | Promega | H5151 | ||
Duolink II Detection Reagents (Orange) | OLINK | 92007-0100 | ||
Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS | Olink Bioscience | 92004-0100 | ||
Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS | Olink Bioscience | 92002-0100 | ||
Duolink II Mounting Medium with DAPI | Olink Bioscience | 82040-0005 | ||
Duolink II Wash Buffers Fluorescence | Olink Bioscience | 82049 |