初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ
Summary
我々はマウス胚組織における組織特異的遺伝子発現の開始中または後に組織特異的遺伝子に要因の相互作用を識別するために、クロマチン免疫沈降（ChIP）法を示しています。それは正常な胚発生時に発生するとして、このプロトコルは、組織特異的遺伝子の活性化の研究に広く適用可能であるべきである。
Abstract
クロマチン免疫沈降（ChIP）はタンパク質を識別するための強力なツールです：1-3生きた細胞のコンテキストで発生するクロマチンの相互作用。この手法は、広く一次組織で、組織培養細胞の中で利用し、より少ない程度にされています。特に開発の早い時間にげっ歯胚組織、チップのアプリケーションは、組織の限られた量と胚の細胞と組織型の不均一性によって複雑になる。ここでは、解離胎生8.5（E8.5）の胚を用いてChIPを行うための方法を提示する。クロマチンの相互作用：単一のE8.5胚からの断片化クロマチンは、コントロールおよび特定の蛋白質の調査のための調査員に十分な材料を可能にするfiveアリコート、するに分けることができます。
組織特異的遺伝子発現プログラムの仕様中にクロマチンの相互作用：我々は、タンパク質を文書化し始めるためにこのテクニックを利用してきた。すべての相互作用が発生するかどうかといった区別なく、クロマチンの相互作用、のサブセット、または単セルのタイプ（S）：結果は、タンパク質の検出であるため、胚の細胞型の不均一性は、必ずしもこの手法の適用を制限する。しかし、組織特異的遺伝子発現の開始時または、以下の組織特異的遺伝子の検査は、2つの理由で実現可能です。最初に、組織特異的因子の免疫沈降は、必ずしも要因が発現する細胞の種類からクロマチンを分離します。遺伝子の活性化に関連付けられている第二に、コアクチベーターとヒストンの免疫沈降を含む翻訳後修飾は、遺伝子と遺伝子がされているか、アクティブ化された細胞のタイプの遺伝子調節配列で発見されるべきである。テクニックは、ほとんどの組織特異的遺伝子の活性化のイベントの調査に適用可能であるべきである。
後述の例では、我々は、骨格筋特異的遺伝子のプロモーターにおける結合因子を調べるためにE8.5及びE9.5のマウス胚を利用した。体幹と四肢の骨格筋が形成する元となる前駆組織である体節は、、E8.5 – 9.5 4,5で存在している。 Myogeninは、骨格筋の分化6月9日に必要な調節因子である。データはmyogeninがE8.5とE9.5の胚においてそれ自身のプロモーターに関連付けられていることを示しています。 myogeninが唯一の開発6,10のこの段階で体節で表されているため、データはそれ自身のプロモーターとmyogeninの相互作用は既にE8.5胚における骨格筋の前駆細胞で発生したことを示している。
Protocol
1。胚の単離 注 ：マウスを含むすべての操作が適切な動物のケアと使用ポリシーとプロトコルに従い実施すること雌マウスの交配のプラグインの存在交配後の朝にチェックして、別のケージに入れて、スタッドの男性から交尾の雌を分離。嵌合プラグが観測された日の正午は、開発の胎生0.5（E0.5）とみなされます。 E8.5で、（または必要な段?…
Discussion
説明したChIPのプロトコールでは、我々は、筋原性レギュレータmyogeninが単一のE8.5及びE9.5の胚に存在する骨格筋の前駆体の組織におけるmyogeninプロモーターに関連付けられていることを示している。先行研究では、広範囲にin vitroでのゲルシフト実験の初期にはin vitroで翻訳や細菌生産myogeninと11月20日標的遺伝子の調節配列の該当する部分をコードする放射性標識DNA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は2009年のアメリカの回復と再投資法を通じて授与資金を含むANI、、とNIH R01 GM87130でたたくのNIH R01 GM56244によってサポートされていました
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| ChIP Assay Kit | Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore | 17-295 | ||
| Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS | |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | Gibco Labs, Invitrogen | 12100-061 | High glucose content | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco Labs, Invitrogen | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | ||
| Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit | |
| Penicillin/streptomycin stock solution | Gibco Labs, Invitrogen | 5000 μg/ml concentration | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | ||
| Salmon sperm DNA /Protein A agarose | Millipore | 16-157 | ||
| myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | ||
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | ||
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | ||
| GoTaq Q-PCR master mix | Promega | A6001 |
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Cite This Article
Cho, O. H., Rivera-Pérez, J. A., Imbalzano, A. N. Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (50), e2677, doi:10.3791/2677 (2011).