ampliPHOX Kolorimetriska Detection på en DNA microarray för influensa
Summary
ampliPHOX kolorimetriska upptäckt teknik framställs som ett billigt alternativ till fluorescens detektion för mikroarrayer. Baserat på photopolymerization, producerar ampliPHOX polymerbränsleceller fläckar synliga för blotta ögat på bara några minuter. Resultaten är sedan avbildas och automatiskt tolkas med ett enkelt men kraftfullt programpaket.
Abstract
DNA microarrays har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för detektion av patogener. 1-5 Till exempel har många exempel på förmågan att skriva och subtyp av influensavirus påvisats. 6-11 Identifiering och subtypning av influensa på DNA microarrays har tillämpningar inom såväl offentlig hälsa och på kliniken för tidig upptäckt, snabbt ingripande, och minimera effekterna av en influensapandemi. Traditionell fluorescens är för närvarande den vanligaste microarray detektionsmetod. Men som microarray-tekniken utvecklas i riktning mot klinisk användning, 1 ersätta dyra instrumentering med låg kostnad detekteringsteknik uppvisar liknande prestanda till fluorescens gör microarray analyser mer attraktiv och kostnadseffektiv.
Den ampliPHOX kolorimetriska upptäckt tekniken är avsedda för forskning tillämpningar och har en detektionsgräns i en storleksordning av traditionella fluorescens 11, med en största fördelen är en cirka tio gånger lägre instrument kostnad jämfört med konfokala microarray skannrar som krävs för fluorescens microarray detektering. En annan fördel är den kompakta storleken på de instrument som möjliggör portabilitet och flexibilitet, till skillnad från traditionella fluorescens instrument. Eftersom polymerisation teknik är inte lika naturligt linjär som fluorescens upptäckt, är det dock bäst för mindre applikationer täthet microarray där ett ja / nej svar för förekomst av en viss sekvens önskas, t.ex. för detektion av patogener arrayer. För närvarande den högsta platsen täthet kompatibel med ampliPHOX upptäckt är ~ 1800 fläckar / array. På grund av de begränsningar plats densitet, högre densitet mikroarrayer är inte lämpliga för ampliPHOX upptäckt.
Här presenterar vi ampliPHOX kolorimetriska upptäckt tekniken som en metod för signalförstärkning på en låg täthet microarray utvecklats för detektering och karakterisering av influensavirus (FluChip). Även om detta protokoll använder FluChip (en DNA microarray) som en specifik tillämpning av ampliPHOX upptäckt, något microarray införliva biotinylerad mål kan märkas och identifieras på ett liknande sätt. Den microarray design och biotinylation av målet som ska fångas är användarens ansvar. När biotinylerad målet har fångat på matrisen, kan ampliPHOX upptäckt utföras genom att först märka arrayen med en streptavidin-etikett konjugat (ampliTAG). Vid ljusexponering med ampliPHOX Reader instrument, en polymerisering av en monomer lösning (ampliPHY) förekommer endast i områden som innehåller ampliTAG-märkta mål. Polymeren som bildas kan sedan färgas med en giftfri lösning för att förbättra visuell kontrast, följt av bildbehandling och analys med ett enkelt programvarupaket (ampliVIEW). Hela FluChip analys från FN-extraherade prov till resultat kan utföras i ca 6 timmar, och ampliPHOX upptäckt stegen som beskrivs ovan kan fyllas i ca 30 min.
Protocol
Discussion
Den ampliPHOX kolorimetriska upptäckt teknik som presenteras här är en snabb, billigt alternativ till enda färg fluorescens detektion för mindre applikationer täthet microarray. Visas schematiskt i figur 1 är upptäckten princip som bygger på användning av ett fotoinitiator etikett (1B). I närvaro av en monomer som innehåller lösning (1C), orsakar ljusexponering de fotoinitiator (ampliTAG) för att utlösa en polymerisationsreaktion bara i märkta regioner (1D). Även visade här på ett DNA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
InDevR erkänner NIH / NIAID U01AI070276 och R43AI077112 för att finansiera detta arbete.
Materials
| Reagent/equipment | Manufacturer | Catalog # | Comments |
|---|---|---|---|
| Qiagen MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | single 60 μl elution |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | optional |
| ABI 9800 Fast Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | kit dNTPs not used |
| 2x Spotting Buffer | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| Biotinylated dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| Lambda exonuclease | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip primer mix | InDevR | N/A | not yet available for sale |
| Orbital Shaker | Madell Technology | ZD-9556-A | |
| Wash Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| Wash Racks | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| 2x Hybridization Buffer | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| Calibration Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| Wash Buffers A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |
References
- Kumar, R. M. The Widely Used Diagnostics “DNA-Microarray”-A Review. Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).
- Miller, M. B., Tang, Y. W. Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology. Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).
- Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. DNA microarrays in the clinic: infectious diseases. BioEssays. 30, 673-682 (2008).
- Call, D. R. Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays. Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).
- Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. What does the future hold for clinical microbiology. Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).
- Dawson, E. D., Rowlen, K. L., Wang, Q., Tao, Y. J. MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A. Influenza: Molecular Virology. , (2010).
- Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray. J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).
- Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray. J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).
- Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. Identifying influenza viruses with resequencing arrays. Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).
- Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses. J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).
- Kuck, L. R., Taylor, A. W. Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays. Biotechniques. 45, 179-186 (2008).
- Avens, H. J., Bowman, C. N. Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays. Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).
- Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. Antigen detection using polymerization-based amplification. Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).
