Grip için DNA Mikroarray ampliPHOX Kolorimetrik Algılama
Summary
ampliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi mikroarray'ler için floresan tespiti için ucuz bir alternatif olarak sunulmaktadır. AmpliPHOX fotopolimerizasyon dayanarak, sadece birkaç dakika içinde çıplak gözle görülebilen katı polimer lekeler oluşturur. Sonuçlar basit ama güçlü bir yazılım paketi ile görüntülü ve sonra otomatik olarak yorumlanır.
Abstract
DNA mikrodizilerinin patojen tespiti için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin 1-5, tip ve alt tip grip virüsü yeteneğini pek çok örnek gösterilmiştir DNA mikrodizilerinin grip 6-11 tanımlama ve alt tipleme hem kamu uygulamalar vardır sağlık ve klinikte erken teşhis, hızlı müdahale ve bir influenza pandemisi etkisini en aza indirmek için. Geleneksel floresan şu anda en yaygın olarak kullanılan mikroarray tespit yöntemi. Ancak, klinik kullanımına yönelik mikroarray teknolojisi ilerledikçe, 1 düşük maliyetli algılama teknolojisi, floresan, benzer bir performans özellikleri sergileyerek, pahalı aletlerle yerine mikroarray deneyleri daha cazip ve uygun maliyetli hale getirecek.
AmpliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi araştırma uygulamaları için tasarlanmıştır ve floresan mikroarray için gerekli konfokal mikroarray tarayıcılar ile karşılaştırıldığında yaklaşık on kat daha düşük cihaz maliyeti olan bir ana avantajı ile, geleneksel floresan 11 büyüklükte bir düzen içinde algılama sınırı vardır . algılama. Diğer bir avantajı, geleneksel floresan araçların aksine, taşınabilirlik ve esneklik sağlayan cihaz, kompakt boyutu. Polimerizasyon teknolojisi floresan algılama gibi doğal doğrusal olmadığından, ancak, bu gibi patojen tespiti diziler için belirli bir sırayla varlığı için bir evet / hayır cevabı istenilen düşük yoğunluklu mikroarray uygulamaları, en uygundur. Şu anda ampliPHOX algılama ile uyumlu en yüksek nokta yoğunluğu ~ 1800 lekeler / dizi. Çünkü nokta yoğunluğu sınırlamaları, yüksek yoğunluklu mikroarray'ler ampliPHOX tespiti için uygun değildir.
Burada, grip virüsleri tespit ve karakterizasyonu (FluChip) için geliştirilen bir düşük yoğunluklu mikroarray sinyal amplifikasyon yöntemi olarak ampliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi mevcut. Bu protokol, benzer bir şekilde etiketlenir ve tespit edilebilir biotinlenmiş hedef içeren herhangi bir mikroarray ampliPHOX algılama, belirli bir uygulama olarak FluChip (DNA mikroarray) kullanmasına rağmen. Çekilecek hedef mikroarray tasarım ve biyotinilasyon kullanıcının sorumluluğundadır. Biotinlenmiş hedef dizi esir edildikten sonra, ilk etiketleme ampliPHOX algılama streptavidin-etiket konjuge (ampliTAG) ile dizi yapılabilir. (AmpliPHY) monomer çözüm ampliPHOX Reader enstrüman, polimerizasyon kullanarak ışık maruz kalma sonucunda ampliTAG etiketli hedefler içeren bölgeler yalnızca oluşur. Oluşan polimer sonradan basit bir yazılım paketi (ampliVIEW) kullanarak görüntüleme ve analiz takip görsel kontrastı artırmak için non-toksik bir çözüm lekeli olabilir. Yaklaşık 6 saat içinde sonuç un çıkarılan örnek tüm FluChip tahlil yapılabilir ve yukarıda açıklanan ampliPHOX algılama adımları yaklaşık 30 dakika içinde tamamlanabilir.
Protocol
Discussion
Burada sunulan ampliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi, düşük yoğunluk mikroarray uygulamalar için tek renkli floresan tespiti için hızlı, ucuz bir alternatif. Şekil 1'de şematik olarak gösterilmiştir, algılama ilkesi kullanımı ile ilgili bir photoinitiator etiket (1B) dayanır. Monomer içeren bir çözüm (1C) varlığı, ışığa maruz kalma photoinitiator (ampliTAG) yalnızca etiketli bölgelerde bir polimerizasyon reaksiyonu tetiklemek için (1D) neden olur. Influenza tanı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
InDevR bu çalışmaları finanse NIH / NIAID U01AI070276 ve R43AI077112 kabul eder.
Materials
| Reagent/equipment | Manufacturer | Catalog # | Comments |
|---|---|---|---|
| Qiagen MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | single 60 μl elution |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | optional |
| ABI 9800 Fast Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | kit dNTPs not used |
| 2x Spotting Buffer | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| Biotinylated dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| Lambda exonuclease | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip primer mix | InDevR | N/A | not yet available for sale |
| Orbital Shaker | Madell Technology | ZD-9556-A | |
| Wash Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| Wash Racks | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| 2x Hybridization Buffer | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| Calibration Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| Wash Buffers A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |
References
- Kumar, R. M. The Widely Used Diagnostics “DNA-Microarray”-A Review. Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).
- Miller, M. B., Tang, Y. W. Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology. Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).
- Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. DNA microarrays in the clinic: infectious diseases. BioEssays. 30, 673-682 (2008).
- Call, D. R. Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays. Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).
- Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. What does the future hold for clinical microbiology. Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).
- Dawson, E. D., Rowlen, K. L., Wang, Q., Tao, Y. J. MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A. Influenza: Molecular Virology. , (2010).
- Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray. J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).
- Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray. J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).
- Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. Identifying influenza viruses with resequencing arrays. Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).
- Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses. J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).
- Kuck, L. R., Taylor, A. W. Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays. Biotechniques. 45, 179-186 (2008).
- Avens, H. J., Bowman, C. N. Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays. Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).
- Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. Antigen detection using polymerization-based amplification. Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).
