Summary
我们描述了一个协议梯度产生的微流体装置,可以产生良好定义的微环境中的空间和时间的梯度微细。在这种方法中,梯度产生的微流体装置可用于研究细胞定向迁移,胚胎发育,伤口愈合,癌症转移。
Abstract
的制造和研究细胞行为的一个梯度产生的微流体装置的操作说明。微流体平台是一个有利的实验工具,因为它可以精确地操纵流体流动,使高通量的实验,并产生稳定的水溶性的浓度梯度。相比传统的梯度发生器,聚二甲基硅氧烷(PDMS)的基于微流体装置,可以产生生长因子具有良好定义的配置文件稳定的浓度梯度。在这里,我们开发了三个独立的进气口简单的梯度产生的微流体装置。三微合并成一个微产生浓度梯度。 isothyiocyanate荧光素(FITC)-葡聚糖的分子量类似表皮生长因子(EGF),生长因子梯度的稳定和形状被证实。我们表明,使用这种微流体装置,暴露表皮生长因子的浓度梯度成纤维细胞对高浓度的迁移。细胞迁移和细胞迁移运动的方向定位,定量评估细胞跟踪分析。因此,该梯度产生的微流体装置,可能是有益的研究和分析细胞迁移的行为。
Protocol
A.梯度产生的微流体装置微细
- 硅晶片被视为与活性氧离子(Harrick科学30W,5分钟,NY)。
- 负型光刻胶(SU - 8 50,Microchem,MA)是在一个硅晶片上的1分钟1000转的旋涂。
- 晶圆是软的烤在65 ° C为10分钟,随后在95 ° C为30分钟一个电磁炉。
- 晶圆暴露在紫外线灯(200W),通过一个30微米的最小特征尺寸的透明度面具3分钟。
- 晶圆是出炉后在65 ° C为1分,在95 ° C为10分钟。
- 四掌握模具100微米厚的渠道是开发利用SU - 8光刻胶开发。
- 含微晶圆被放置在一个Petri盘。
- 聚二甲基硅氧烷(PDMS)中(Sylgard 184)模具制造混合的有机硅弹性体和固化剂(10:1)。
- 泗母模的PDMS混合物倒入。
- 四母模是放在真空干燥器除去10分钟的气泡。
- PDMS的是固化在70 ° C,1〜2小时。
- 从四母模的PDMS模具揭下。
B.实验装置
- 细胞的入口,出口,并注入进气口的PDMS微设备使用锋利打孔器打孔。
- 是不可逆转的保税的活性氧等离子(Harrick科学30W,5分钟,纽约州)的设备和载玻片(2 × 3英寸)。
- 聚乙烯管(PE 20,流式细胞Dickinon,MD)被插入到微流体装置注入进气口,随后连接到一个注射器泵。
- 异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖(MW = 10kD,10μM,Sigma公司)和缓冲液(PBS,Invitrogen公司,CA)注入到微流体装置内的流体设备,以确认稳定的梯度。
- 培养箱中培养1小时(37℃)的微流体装置内涂外基质(ECM)(即纤维连接蛋白)。
- 的NIH 3T3成纤维细胞,胰酶消化分离。
- 游离细胞被加载到微流体装置(宽800微米),在细胞密度2 × 10 6细胞/ ml 。
- 注入2毫升媒体和50 ng / mL表皮生长因子(EGF)是一个微流体装置,使用注射泵(0.05微升/分钟)生成可溶性梯度。
- 细胞实时监测每5分钟,通过倒置显微镜(尼康TE的2000)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
细胞暴露于稳定的表皮生长因子的浓度梯度,在向着更高浓度的迁移一个微流体装置。细胞跟踪分析,细胞迁移,趋化指数,细胞迁移运动的方向定位进行了调查。因此,该梯度产生的微流体平台可用于研究癌细胞转移,胚胎发育和轴突导向。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Dextran-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | FD10S | Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD) |
hr-EGF | Invitrogen | 13247-051 | human recombinant Epidermal growth factor | |
PDMS | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) | |
Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 50 | ||
Si wafer | silicone wafer, 4 inch | |||
Petri dishes | ||||
Polyethylene tubing | BD Biosciences | PE 20 | ||
PBS | Invitrogen | |||
Fibronectin | ||||
NIH 3T3 | cell-line | fibroblast cells | ||
Inverted microscope | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
- Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).
- Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5, 401-406 (2005).
- Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).